孟 銳 蔡思琦 姜春香 隆曉菁 張麗娟

1(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055)

2(中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

1 引 言

小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦的常駐免疫細(xì)胞，廣泛分布于腦和脊髓，約占 10%～20% 膠質(zhì)細(xì)胞[1]。且腫瘤相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞(Glioma-associated microglias，GAMs)是構(gòu)成膠質(zhì)瘤微環(huán)境的主要成分之一，對腫瘤的發(fā)展產(chǎn)生多重影響[2]。GAMs 在惡性膠質(zhì)瘤內(nèi)的密度較其他等級膠質(zhì)瘤要大，且可影響患者生存期的長短[3]。雖然GAMs 的起源仍然存在爭議[3]，但有研究表明GAMs 在膠質(zhì)瘤的影響下，可被募集到膠質(zhì)瘤微環(huán)境中，釋放出廣泛的生長因子和細(xì)胞因子以促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。據(jù)報道，活化的 GAMs可分泌促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷再生的生長促進(jìn)因子[5]。Kasahara 等[6]發(fā)現(xiàn)小鼠海馬腦片培養(yǎng)物中小膠質(zhì)細(xì)胞的異質(zhì)性隨時間的變化而改變，且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)各種疾病中也展現(xiàn)了小膠質(zhì)細(xì)胞的密度有著顯著的異質(zhì)性[7]，表明小膠質(zhì)細(xì)胞的異質(zhì)性隨時間、質(zhì)量和位置的變化而變化。作為膠質(zhì)瘤微環(huán)境的重要組成部分，小膠質(zhì)細(xì)胞與膠質(zhì)瘤細(xì)胞間相互作用，并且這種相互作用可能促進(jìn)了腫瘤的增殖和侵襲[8]。已有研究表明，膠質(zhì)瘤細(xì)胞會募集和激活小膠質(zhì)細(xì)胞以利于自身的增殖和侵襲[9]，而外周的巨噬細(xì)胞和原位小膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成了主要的膠質(zhì)瘤浸潤細(xì)胞[10]。這些研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞是膠質(zhì)瘤微環(huán)境的主要成分之一，并可能對膠質(zhì)瘤的增值和侵襲具有促進(jìn)作用，但在影響膠質(zhì)瘤侵襲的過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞的分布狀況仍不清楚。因此，本實驗旨在通過建立 C6 大鼠模型，以探究全腦小膠質(zhì)細(xì)胞的分布對膠質(zhì)瘤侵襲性的影響。

2 實驗材料與方法

2.1 材料

大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞 C6 購于上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫/干細(xì)胞庫。雌性 SD 大鼠 28 只，鼠齡約為 7 周，質(zhì)量 250 g 左右，為 SPF 級清潔級動物，購于北京維通利華公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本 Panasonic 公司)，AIRTECH 超凈臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，腦立體定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，微量注射泵(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，10 μL 微量注射器(美國 Hamilton 公司，型號為 701)，磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS，美國 Invitrogen 公司)，新生小牛血清(美國 Sigma 公司)，DEME 培養(yǎng)基(美國 Invitrogen 公司)，青霉素/鏈霉素雙抗(美國 Invitrogen 公司)。西門子 3T 磁共振成像系統(tǒng)(德國 SIEMENS 公司，型號為 Tim Trio)，萊卡切片機(jī)(德國 Leica 集團(tuán))。涉及到動物相關(guān)的實驗均得到了中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院動物倫理委員會的批準(zhǔn)(SIAT-IRB-160506-YGSZHR-A0229)。

2.2 方法

2.2.1 C6 大鼠膠質(zhì)瘤模型構(gòu)建

首先，將 10% 水合氯醛(0.3 mL/100 g)于大鼠腹腔內(nèi)注射 1 mL 麻醉劑后，采用立體定位儀固定大鼠頭部，手術(shù)暴露顱骨標(biāo)志。其次，于囟穴(Bregma)點右側(cè) 3 mm、上側(cè) 1 mm 處，以注射器針頭鉆孔后，使用微量注射器抽取細(xì)胞懸液固定于定位儀，沿骨孔緩慢進(jìn)針至硬腦膜下6 mm，退針 1 mm，以 1 μL/min 的速度注入細(xì)胞懸液 10 μL，注射后留針 5 min 再緩慢退針[11]。最后，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮切口后消毒皮膚。術(shù)后以每籠 3～4 只大鼠進(jìn)行飼養(yǎng)，成功建立 28 只膠質(zhì)瘤大鼠模型。

2.2.2 磁共振成像和腫瘤直徑測量

分別在種瘤后第 7、9、12、14、16、18、22、23、24 天進(jìn)行核磁共振 T2 加權(quán)成像掃描(T2 Weighted Magnetic Resonance Imaging，T2WI)。具體步驟為：先用 3% 的異氟烷混合氧氣吸入誘導(dǎo)麻醉；然后，再將 1.5% 異氟烷通過通氣管道讓大鼠持續(xù)鼻腔吸入進(jìn)行麻醉；最后，將大鼠門齒固定于小動物線圈進(jìn)行磁共振成像(MRI)掃描，主要成像參數(shù)為重時間 4 000 ms、回波時間 85.7 ms、層數(shù) 16、層厚 1.5 mm、FOV＝59 mm。最終依據(jù)實體瘤的體積評價標(biāo)準(zhǔn)RECIST[12]，在腫瘤徑線最大的冠狀位層面測量其最大直徑，同時記錄該層面內(nèi)腫瘤的平均 T2信號強(qiáng)度。

2.2.3 全腦組織病理染色和免疫熒光染色

磁共振成像獲取相關(guān)數(shù)據(jù)后，首先，犧牲實驗動物并取出 28 只大鼠的大腦進(jìn)行組織切片蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)染色(30 μm)和免疫熒光染色。其中，鈣離子結(jié)合的受體分子(Ionized Calcium-Binding Adapter Molecule，IBA-1)對小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記[13]，4′, 6-二脒基-2-苯基吲(4′, 6-Diamidino-2-Phenylindole，DAPI)對細(xì)胞核進(jìn)行標(biāo)記[14]。其次，利用尺度不變特征變換(SIFT)算法[15]檢測HE 染色圖像與免疫熒光圖像中的不變特征，并在兩幅圖像之間的區(qū)域灰度、特征向量空間分布和特征符號描述進(jìn)行匹配，以進(jìn)行變換模型參數(shù)的估計，包括仿射變換、投影變換和非線性變換。最后，將 HE 染色圖像變換到免疫熒光圖像的空間域進(jìn)行圖像融合，從而找到 HE 染色圖像標(biāo)注的 9 個與免疫熒光圖像對應(yīng)的感興趣區(qū)域(Regions of Interest，ROI)，進(jìn)而計算 9 個 ROI的小膠質(zhì)細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。并采用線性回歸與曲線估算的方法評估小膠質(zhì)細(xì)胞分布的時空特性與膠質(zhì)瘤進(jìn)展的關(guān)系(SPSS 23.0)，其中P＜0.01表示有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。實驗過程如圖 1 所示。

圖1 C6 大鼠模型建模示意圖以及感興趣區(qū)域的選取Fig. 1 Illustration of the experimental procedures

3 結(jié)果

3.1 C6 膠質(zhì)瘤進(jìn)程與各感興趣區(qū)域內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞密度的測量分析

種瘤 1 周后可在 T2WI 上觀察到明顯的膠質(zhì)瘤信號。膠質(zhì)瘤內(nèi)部平均熒光強(qiáng)度顯著大于其他ROI 的平均熒光強(qiáng)度值(P＜0.001)，9 個 ROI 的小膠質(zhì)細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度測量結(jié)果如圖 2 所示。隨著腫瘤生長，各 ROI 內(nèi)平均熒光強(qiáng)度與腫瘤直徑之間呈顯著正相關(guān)。當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到 9 mm時，各 ROI 平均熒光強(qiáng)度之間的差異顯著增加(圖 3、表 1)。

圖2 各個成瘤階段不同 ROI 中的平均熒光強(qiáng)度分布Fig. 2 Summary of the average mean density in the def i ned ROIs according to the staged growth time

圖3 平均熒光強(qiáng)度與膠質(zhì)瘤最大直徑呈線性相關(guān)的關(guān)系Fig. 3 The relationship between the diameter of glioma and the mean density of microglia for all the ROIs

表1 平均熒光強(qiáng)度與膠質(zhì)瘤最大直徑擬合的相關(guān)統(tǒng)計學(xué)參數(shù)Table 1 Summary of the statistical parameters of the linear regressions between mean density and day

3.2 平均熒光強(qiáng)度與成瘤時間的相關(guān)性分析

圖4中平均熒光強(qiáng)度與成瘤時間的相關(guān)性分析顯示，腫瘤內(nèi)部和非腫瘤區(qū)域各 ROI 的平均熒光強(qiáng)度隨著成瘤時間的增加均呈二次曲線增加(R2＝0.91,F＝129.49,P＜0.001)。腫瘤直徑達(dá)到 9 mm 所對應(yīng)的成瘤時間為 16～18 天，在該時間段內(nèi)，即腫瘤區(qū)域平均熒光強(qiáng)度隨著成瘤時間的增加而增加，且增加速度顯著高于非腫瘤區(qū)ROI 。

圖4 平均熒光強(qiáng)度隨著成瘤時間呈二次曲線增加Fig. 4 Mean density increased with time and was best fi tted to binomial functions for all ROIs

3.3 平均熒光強(qiáng)度與 T2WI 平均信號強(qiáng)度的相關(guān)性分析

在測量了腫瘤區(qū)域的 T2WI 平均信號強(qiáng)度后，通過擬合信號強(qiáng)度與腫瘤區(qū)域平均熒光強(qiáng)度的數(shù)值發(fā)現(xiàn)，信號強(qiáng)度與平均熒光強(qiáng)度呈顯著正相關(guān)(R2＝0.80,F＝45.45,P＜0.001)，結(jié)果如圖 5所示。

圖5 信號強(qiáng)度與平均熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)關(guān)系Fig. 5 Positive correlation between the average signal intensity on T2WI and the mean density of microglia for C6 glioma

3.4 腫瘤最大直徑與成瘤時間的相關(guān)性分析

圖 6 結(jié)果顯示，腫瘤直徑與成瘤時間呈顯著正相關(guān)(R2＝0.72,F＝68.36,P＜0.001)。當(dāng)成瘤時間達(dá)到 16～18 天時，腫瘤直徑的異方差顯著增大。

圖6 腫瘤直徑隨著成瘤時間的增加而線性增長Fig. 6 Positive correlation between days after C6 implantation and the tumor diameter

4 討論分析

本研究表明在腫瘤生長的過程中，腫瘤同側(cè)和對側(cè)的小膠質(zhì)細(xì)胞均參與了膠質(zhì)瘤的侵襲，并且小膠質(zhì)細(xì)胞的時空異質(zhì)性隨著膠質(zhì)瘤體積的增大而增加。實驗結(jié)果和數(shù)據(jù)分析表明，原位膠質(zhì)瘤可能觸發(fā)了全腦小膠質(zhì)細(xì)胞的趨化，而小膠質(zhì)細(xì)胞的時空異質(zhì)性可能蘊(yùn)含著膠質(zhì)瘤的進(jìn)展機(jī)制。

已有動物實驗證明，小膠質(zhì)細(xì)胞在 C6 大鼠模型中顯示出類似于人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的免疫微環(huán)境和免疫抑制功能[16]。盡管 C6 膠質(zhì)瘤在激發(fā)同種免疫時有一定的局限性[17]，但它對研究低級別膠質(zhì)瘤的治療是一個有效的模型[18]。同時，也有報道指出大鼠 C6 膠質(zhì)瘤模型類似于人類中級(II 級)到高級別(IV 級)的膠質(zhì)瘤[19,20]，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的基因表達(dá)方面，C6 大鼠模型與人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤有一定的相似性[21]。因此，采用 C6動物模型研究小膠質(zhì)細(xì)胞對膠質(zhì)瘤的影響，對人腦膠質(zhì)瘤的研究具有重要參考意義。

本研究中，腫瘤直徑達(dá)到 9 mm 后小膠質(zhì)細(xì)胞分布的異質(zhì)性更加明顯。首先，灌流后測得的大鼠大腦的平均橫向長度為 14.18 mm(12.9～15.0 mm)，說明當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到 9 mm 時，膠質(zhì)瘤已經(jīng)侵入對側(cè)大腦半球，生物侵襲性增加。膠質(zhì)瘤的加速發(fā)展常伴隨基因組異質(zhì)性的增大[22]，進(jìn)而可能導(dǎo)致膠質(zhì)瘤相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞趨化并表現(xiàn)出更強(qiáng)的異質(zhì)性。其次，以往研究發(fā)現(xiàn) C6 膠質(zhì)瘤發(fā)展過程中存在自愈傾向，即部分腫瘤可能發(fā)生不同程度的體積縮小或消失傾向，使得腫瘤直徑和小膠質(zhì)細(xì)胞測量值的分布進(jìn)一步復(fù)雜化。最后，膠質(zhì)瘤環(huán)境下小膠質(zhì)細(xì)胞趨化特性自身的多樣性也可能導(dǎo)致其時空異質(zhì)性增加。有研究發(fā)現(xiàn)，C6 大鼠模型在成瘤 10～20 天時，腫瘤結(jié)節(jié)內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞密度達(dá)到峰值[23]。本研究中，膠質(zhì)瘤模型直徑達(dá)到 9 mm 是在種瘤 16～18 天后，在這一時間內(nèi)，不同腫瘤個體的小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤達(dá)到峰值的時間差異也可能導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞密度異質(zhì)性的增加。

本研究也具有一定的局限性。如在 C6-SD 大鼠膠質(zhì)瘤模型中，部分大鼠膠質(zhì)瘤具有自愈的傾向，因此大鼠模型的實驗結(jié)果對臨床應(yīng)用還需進(jìn)一步研究。同時，IBA-1 染色結(jié)果中的小膠質(zhì)細(xì)胞有部分是大腦固有小膠質(zhì)細(xì)胞，與膠質(zhì)瘤促進(jìn)無關(guān)，但數(shù)量相對而言較少，對實驗結(jié)果影響不大。

正常情況下，大鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞在數(shù)量、功能、形態(tài)及空間分布上均有一定的異質(zhì)性。理論上，大鼠大腦中固有的小膠質(zhì)細(xì)胞可能對本實驗平均熒光強(qiáng)度的測量有一定的干擾。但在本實驗中，全腦范圍內(nèi)的非腫瘤區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞密度與膠質(zhì)瘤進(jìn)展顯著相關(guān)，這一結(jié)果更可能源于膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞異常定植。Juliano 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤的進(jìn)展促進(jìn)腫瘤浸潤邊緣的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和定植能力。Engelhorn 等[25]進(jìn)行的動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，種瘤區(qū)域周圍確有大量的活化小膠質(zhì)細(xì)胞，在腦外傷動物模型中也檢測到病灶以外的大腦微結(jié)構(gòu)異常與小膠質(zhì)細(xì)胞增加密切相關(guān)[26]。此外，膠質(zhì)瘤缺血壞死也是誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤的重要原因[27]。但本研究的膠質(zhì)瘤標(biāo)本 HE 染色光鏡下均未見明顯壞死區(qū)域，腫瘤的 T2WI 信號未見明顯不均的高信號。因此，本實驗中非腫瘤區(qū)域的小膠質(zhì)細(xì)胞定植應(yīng)為膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)的免疫響應(yīng)，且膠質(zhì)瘤進(jìn)展引發(fā)全腦范圍內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞定植，其空間異質(zhì)性與腫瘤的大小以及與腫瘤的距離有關(guān)，并隨著腫瘤的進(jìn)展呈加速趨勢。同時，小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤增加了膠質(zhì)瘤內(nèi)的細(xì)胞含量，并促進(jìn)了細(xì)胞外基質(zhì)重塑，可能是導(dǎo)致 T2WI 信號隨小膠質(zhì)細(xì)胞密度增加而增加的原因。

5 結(jié) 論

膠質(zhì)瘤在發(fā)生、發(fā)展過程中觸發(fā)了全腦范圍的小膠質(zhì)細(xì)胞定植，其空間異質(zhì)性與腫瘤的大小及腫瘤的距離有關(guān)，并隨著腫瘤的進(jìn)展呈加速趨勢。這些發(fā)現(xiàn)提示，在預(yù)測膠質(zhì)瘤生物侵襲性、評估治療響應(yīng)和靶向微環(huán)境治療膠質(zhì)瘤的實驗研究中，有必要從全腦范圍評估小膠質(zhì)細(xì)胞的作用。