高效液相色譜-質(zhì)譜測定豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤殘留

◎ 李玥穎

（譜尼測試科技（天津）有限公司，天津 300392）

目前，市場上銷售的豆芽的下胚軸多粗壯、白嫩，增加了豆芽的美觀，但是這種豆芽的危害比較大。其中，豆芽中的4-氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤是導(dǎo)致“毒豆芽”事件的主要成分，而且4-氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤的殘留量沒有國家標(biāo)準(zhǔn)，只有地方標(biāo)準(zhǔn)，在豆芽中的殘留量不能超過0.001 mg/kg。本研究以市場上購買的綠豆芽為樣品，對豆芽中的4-氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤殘留進(jìn)行測定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

綠豆芽，20 kg，購自北京市菜市場中5個(gè)不同的商家。

1.2 儀器和試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Waters公司，Waters BEH-C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）。

4-氯苯氧乙酸鈉（純度為99%）和6-芐基腺嘌呤（純度為99%），Sigma（美國）公司；甲醇，市售分析純和色譜純；乙醚、鹽酸、氯化鈉、冰醋酸、氫氧化鈉（NaoH），市售分析純；水，應(yīng)符合GB/T6682規(guī)定的二級水。

4-氯苯氧乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)工作液，用甲醇逐級稀釋10 μg/mL 4-氯苯氧乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)中間液，得到10、20、50、100、200 μg/L等適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

6-芐基腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)工作液，用甲醇逐級稀釋10 μg/mL 6-芐基腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)中間液，得到5、10、25、50、100 ng/mL等適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。固相萃取柱：ODS-C18（500 mg/6 mL），預(yù)先用5 mL甲醇洗脫活化，再用5 mL水洗去殘留甲醇，保持萃取柱潤濕狀態(tài)待用[1]。

1.3 樣品中的4-氯苯氧乙酸鈉提取及凈化方法

稱取粉碎后的樣品10 g，用0.01 mol/L NaOH超聲提取，離心取上清液，再次用NaOH超聲提取，離心取上清液用NaOH定容，加入鹽酸、乙醚萃取酸，用氯化鈉酸性溶液洗滌，棄水層，乙醚層旋轉(zhuǎn)蒸干，甲醇定容，HPLC-MS測定。

1.4 樣品中的6-芐基腺嘌呤提取及凈化方法

稱取粉碎后的樣品10 g，采用100 mL甲醇+水的濃度體積（50/50）酸化甲醇水超聲提取，離心取上清液，再次酸化甲醇超聲提取，離心取上清液懸蒸水相剩余約10 mL，水相經(jīng)C18凈化活化（5 mL甲醇、5 mL水），淋洗，洗脫，洗脫液用N2吹干，甲醇定容，HPLC-MS 測定[2]。

1.5 HPLC-MS條件

1.5.1 4-氯苯氧乙酸鈉的色譜條件

色譜柱，Waters BEH-C18，2.1 mm×50 mm，1.7 μm；流動相，A 100%甲醇，B 0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫，洗脫程序見表1。流速，0.25 mL/min；柱溫，30 ℃；進(jìn)樣量，10 μl。

表1 流動相洗脫程序表

1.5.2 4-氯苯氧乙酸鈉的質(zhì)譜條件

離子源，ESI；監(jiān)測方式，MRM多反應(yīng)監(jiān)測；離子源溫度，110 ℃；去溶劑溫度，350 ℃；離子對、錐孔電壓、碰撞能量。具體見表2。

表2 離子對、錐孔電壓、碰撞能量表

1.5.3 6-芐基腺嘌呤的色譜條件

色譜柱：Waters BEH-C18，2.1 mm×50 mm，1.7 μm。

流動相，A 100%甲醇，B 0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫，洗脫程序見表3。流速，0.25 mL/min；柱溫，30 ℃；進(jìn)樣量，10 μL。

表3 流動相洗脫程序表

離子源，ESI；監(jiān)測方式，MRM多反應(yīng)監(jiān)測；離子源溫度，110 ℃；去溶劑溫度，350 ℃；離子對、錐孔電壓、碰撞能量，具體見表4。

表4 離子對、錐孔電壓、碰撞能量表

2 結(jié)果與討論

2.1 線性回歸方程、線性范圍和檢出限

由表5可知，在線性范圍之內(nèi)，各種4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的峰面積與含量之間有良好的線性關(guān)系。此外，從最低檢出限的數(shù)據(jù)也可以看出，這種方法具有較高的靈敏度，可對樣品中的4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤進(jìn)行定量分析。

表5 4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的回歸方程、線性范圍和最低檢測限表

2.2 4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的精密度

重復(fù)吸取4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤溶液各10 μL（n=5），按4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤測定方法進(jìn)行進(jìn)樣分析，根據(jù)峰面積計(jì)算各種4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤檢測結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果分別為0.42%和0.47%，說明方法的精密度良好。

2.3 加標(biāo)回收率

稱取3份樣品，按4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的測定方法進(jìn)行操作，統(tǒng)計(jì)計(jì)算3份樣品中4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的含量。另取同樣重量的3份樣品加入100 μL的4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤標(biāo)液，按同樣方法測定加標(biāo)后的4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的含量。分別統(tǒng)計(jì)計(jì)算平均加標(biāo)回收率，結(jié)果見表6。4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的平均加標(biāo)回收率為99.8%和102.4%，說明方法具有良好的準(zhǔn)確性[3]。

表6 4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的加標(biāo)回收率表

2.4 5個(gè)樣品中的4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的結(jié)果與討論

本研究采用HPLC-MS方法對5個(gè)綠豆芽樣品中的4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤進(jìn)行測定，具體見表7。這5個(gè)商家的綠豆芽均存在4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤殘留，殘留量從0.05～0.14 mg/kg。

表7 5個(gè)樣品中4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的殘留量表（mg/kg）

3 結(jié)論

4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤檢測方法最低檢出限分別為0.02、0.04 ng，線性相關(guān)系數(shù)分別為0.999 8、0.999 9，回收率為99.8%、102.4%。采集的5個(gè)樣品中均存在4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤殘留，殘留量未0.05～0.14 mg/kg。4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的測定適合豆芽的色譜質(zhì)譜條件，HPLC-MS的靈敏性和準(zhǔn)確性比較高，可以用于豆芽中的4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤殘留量的測定。