5—氨基酮戊酸光動力對大鼠痤瘡模型免疫功能的影響

陳向齊 宋洪濤 陳勝平

[摘要]目的：探討5-氨基酮戊酸光動力（5-aminolevulinicacid photodynamic therapy，5-ALA-PDT）對大鼠痤瘡模型局部免疫功能的影響及相關機制。方法：將痤瘡丙酸桿菌接種大鼠耳部，建立大鼠痤瘡炎癥模型，給予5-ALA-PDT治療。對組織進行HE染色，采用免疫組化法檢測大鼠巨噬細胞CD68、CD163、Toll樣受體2（Toll-like receptor-2，TLR2）、髓樣分化因子88（MyD88）的表達。結(jié)果：痤瘡丙酸桿菌接種于大鼠耳部可建立大鼠痤瘡炎癥模型，HE染色見大量炎性細胞彌漫性浸潤。CD68、CD163、TLR2、MyD88在大鼠耳部皮膚炎癥細胞質(zhì)內(nèi)表達，空白組較少，接種P.acnes后表達增高，加激動劑Pam3CSK4后表達更高，5-ALA-PDT治療后較P.acnes組低。結(jié)論：大鼠耳部毛囊皮脂腺及周圍可少量表達TLR2，接種痤瘡丙酸桿菌后，表達顯著增加，導致巨噬細胞等免疫細胞向毛囊皮脂腺周圍聚集。5-ALA-PDT治療后TLR2表達減少，減弱機體對細菌的免疫反應，從而減輕炎癥。

[關鍵詞]5-氨基酮戊酸；光動力；痤瘡丙酸桿菌；痤瘡；CD68；CD163；TLR2；MyD88

[中圖分類號]R758.73+3 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）06-0051-04

Abstract： Objective To study the influence of 5-ALA-PDT on the Toll-like receptor-mediated immune response in acne model in SD rats. Methods Acne inflammation model of rat ear induced by Propionibacterium acnes were established and then treated with 5-ALA-PDT. Section was made for HE staining. Immunohistochemical staining was used to observe the expression of CD68， CD163， TLR2， and MyD88. Results Acne inflammation model of rat ear was established by inoculating Propionibacterium acnes to rat ears. Diffuse infiltrations of inflammatory cell were observed by HE staining. Compared with the blank group， the expression of CD68， CD163， TLR2， MyD88 were decreased in rat ears inflammatory cells， but increased after stimulated with P.acnes and increased further after Pam3CSK4 adminstration. The expression level decreased and was lower than the model group after received 5-ALA-PDT. Conclusion TLR2 expression was low in rat ear pilosebaceous unit and its surrounding tissue and the expression increased significantly after inoculating Propionibacterium acnes， which induced macrophage infitration in pilosebaceous unit. 5-ALA-PDT decreased the expression of TLR2 and alleviates bodys immune response to bacteria， thus relieved inflammation

Key words： 5-aminolevulinic acid； photodynamic therapy； Propionibacterium acnes； acne vulgaris； CD68； CD163； TLR2； MyD88

痤瘡病變第一步為以毛囊皮脂腺單位的亞臨床微粉刺，可能演變成封閉或開放粉刺和炎性病變，如丘疹、膿皰、結(jié)節(jié)和囊腫。粉刺形成被認為是涉及到毛囊的角化過度，繼發(fā)于毛囊濾泡角質(zhì)形成細胞過度角化以及它們脫屑減少。炎性細胞因子IL-1參與此過程，并誘導角化過度。微粉刺或粉刺后來可能發(fā)展成炎癥病變，結(jié)果CD4+T細胞活化和遷移，角質(zhì)形成細胞分泌細胞因子以及巨噬細胞和嗜中性粒細胞聚集到毛囊、皮脂腺，增強皮脂分泌[1]。其中，導致痤瘡的發(fā)病因素主要是痤瘡丙酸桿菌，是正常皮膚菌群的一部分，但它在痤瘡患者的毛囊皮脂腺內(nèi)明顯增加[2]。痤瘡丙酸桿菌通過誘導單核細胞分泌促炎癥細胞因子包括TNF-α、IL-1和IL-8導致炎癥發(fā)生，特別是IL-8以及其它痤瘡丙酸桿菌誘導的趨化因子可召集嗜中性粒細胞到毛囊皮脂腺中發(fā)揮重要作用。此外，痤瘡丙酸桿菌釋放的脂肪酶、蛋白酶和透明質(zhì)酸酶可導致組織損傷[3]。然而，這種細菌在痤瘡的發(fā)病機制中的確切作用仍需進一步闡明。

1 材料和方法

1.1 菌液的制備：挑取單個痤瘡丙酸桿菌（ATCC6919，廣東微生物研究所）的菌落，并接種于厭氧腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（青島海博生物技術有限公司）中，在37℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)3d，用麥氏比濁法計數(shù)，以生理鹽水調(diào)配細菌濃度至1×108cells/ml。

1.2 實驗動物處理：從福建醫(yī)科大學動物實驗中心購置清潔級雌性SD大鼠[合格證號：SCXK（閩）2012-0001]48只，均為3周齡，體重約100～120g。經(jīng)醫(yī)院動物倫理委員會（批件號：2014038）審核認證。實驗前大鼠耳部備皮。備皮清理完畢后，48只大鼠隨機分成4組，空白組、P.acnes組、P.acnes+Pam3CSK4（激動劑，北京中科邁晨科技有限公司）組、P.acnes+ALA-PDT組，每組各12只?？瞻捉M雙耳注射無菌生理鹽水（50μl/200g）。厭氧環(huán)境下培養(yǎng)痤瘡丙酸桿菌，并接種于其余3組SD大鼠雙耳（50μl/200g），誘導炎癥反應1周后，用無菌針頭挑取耳廓腫脹部位，接種于厭氧腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中，在37℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)3d，證明為痤瘡丙酸桿菌感染[4]。對P.acnes+ALA-PDT組的大鼠進行5-ALA-PDT治療，常規(guī)酒精消毒照射區(qū)皮膚，腹腔注射氯胺酮（100mg/kg）麻醉動物，P.acnes+ALA-PDT組大鼠雙耳外敷5% ALA（上海復旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司），避光封包1.5h，擦拭干凈后用LED-IB光動力治療儀（武漢亞格光電技術有限公司）照射。照光方案為每周1次，共3周。參數(shù)設定為：能量密度100mW/cm2，波長（633±10nm），照射時間設定為10min，能量60J/cm2?？瞻捉M、P.acnes組、P.acnes+Pam3CSK4 組大鼠均于注射后第3周處死，P.acnes+ALA-PDT組大鼠于5-ALA-PDT治療完畢后立即處死。

1.3 免疫組化法檢測各組CD68、CD163、TLR2、MyD88表達情況：常規(guī)石蠟切片，HE染色。石蠟切片脫蠟和水化，組織抗原用高壓修復。每張切片加1滴3%過氧化氫溶液，在室溫下孵育10min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。每張切片加入1滴一抗（CD68、MyD88的濃度為1：100，CD163、TLR2的濃度為1：50）[CD68、CD163（大鼠）多克隆抗體，購自中杉金橋生物技術開發(fā)有限公司；TLR2多克隆抗體購自上海鈺博生物科技有限公司；MyD88多克隆抗體購自上海安研商貿(mào)有限公司]，室溫下孵育60min。每張切片加入1滴聚合物增強劑（試劑A），在室溫下孵育20min。每張切片加入1滴酶標抗鼠聚合物（試劑B），在室溫下孵育30min。每張切片加入2滴新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，陽性顯色為棕黃色。蒸餾水沖洗3次，蘇木素復染，0.1%鹽酸分化，自來水沖洗，最后用PBS沖洗1次，水性封片劑封片。

1.4 評價指標：TLR2、MyD88、CD68、CD163陽性表達位于上皮細胞和巨噬細胞細胞質(zhì)內(nèi)，TLR2在細胞膜也有表達，鏡下所見均為棕黃色顆粒狀。以CD68、CD163、TLR2和MyD88陽性染色強度及（或）陽性細胞數(shù)分為3級：陰性（-）：有10%以下大鼠耳部巨噬細胞著色；弱陽性（±）：11%～50%以下大鼠耳部巨噬細胞著色；陽性（+）：有50%以上大鼠耳部巨噬細胞著色[5]。

1.5 統(tǒng)計學分析：實驗數(shù)據(jù)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，等級資料行多組非參數(shù)秩和檢驗（Kruskal-Wallis Test），P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠耳部皮膚外觀大體表現(xiàn)：空白組大鼠耳部皮膚正常；P.acnes組大鼠耳部皮膚紅腫明顯；P.acnes+Pam3CSK4組大鼠耳部皮膚紅腫顯著；光動力治療后大鼠耳部皮膚紅腫消退，顏色接近正常。見圖1。

2.2 大鼠耳部皮膚組織病理檢測結(jié)果：HE染色結(jié)果顯示，空白組大鼠表皮較薄，毛囊、皮脂腺結(jié)構(gòu)正常；P.acnes組可見大量炎癥細胞浸潤；P.acnes+Pam3CSK4 組有大量炎癥細胞浸潤；P.acnes+ALA-PDT組毛囊真皮層可見少量炎性細胞。見圖2。

2.3 免疫組織化學檢測結(jié)果

2.3.1 大鼠耳部皮膚TLR2含量檢測結(jié)果：TLR2免疫組化染

色結(jié)果顯示主要在大鼠耳部上皮細胞和巨噬細胞胞膜和細胞質(zhì)內(nèi)彌漫性陽性表達，呈棕黃色，毛囊、皮脂腺也有陽性表達（見圖3）。P.acnes+Pam3CSK4 組含量最高，各組具體情況見表1。

2.3.2 大鼠耳部皮膚MyD88含量檢測結(jié)果：MyD88免疫組化染色結(jié)果顯示主要在大鼠耳部上皮細胞、巨噬細胞胞質(zhì)內(nèi)彌漫性陽性表達，呈棕黃色，毛囊、皮脂腺也有陽性表達（見圖4）。P.acnes+Pam3CSK4 組含量最高，各組具體情況見表2。

2.3.3 大鼠耳部皮膚CD68含量檢測結(jié)果：CD68免疫組化染色結(jié)果顯示主要在大鼠耳部上皮細胞、巨噬細胞胞質(zhì)內(nèi)彌漫性陽性表達，呈棕黃色，毛囊、皮脂腺也有陽性表達（見圖5）。P.acnes+Pam3CSK4組含量最高，各組具體情況見表3。

2.3.4 大鼠耳部皮膚CD163含量檢測結(jié)果：CD163免疫組化染色結(jié)果顯示主要在大鼠耳部上皮細胞和巨噬細胞胞質(zhì)內(nèi)彌漫性陽性表達，呈棕黃色，毛囊、皮脂腺也有陽性表達（見圖6）。P.acnes+Pam3CSK4 組含量最高，各組具體情況見表4。

3 討論

3.1 TLR2：目前，10多種TLRs在人類中確定，這些受體的微生物配體已被證實，TLR4能介導宿主對革蘭陰性菌脂多糖反應，TLR2介導宿主革蘭氏陽性菌的肽聚糖反應，而TLR5介導宿主對細菌鞭毛蛋白反應[6]。當Toll樣受體暴露于微生物的配體后被激活，TLR的胞內(nèi)部分可能引發(fā)MyD88依賴性途徑參與，比如IL-1受體相關激酶和腫瘤壞死因子受體活化因子6，最終導致轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的核轉(zhuǎn)位。NF-κB然后調(diào)節(jié)許多免疫反應基因[7]。

Kim J等[3]用TLR基因敲除小鼠檢查由痤瘡丙酸桿菌介導的激活的TLR6與TLR1的作用。腹膜巨噬細胞是從野生型、TLR2-/-、TLR6-/-和TLR1-/-TLR2-/-小鼠獲得，用痤瘡丙酸桿菌激活，并且上清液測定炎性細胞因子IL-6的存在。痤瘡丙酸桿菌能誘導野生型小鼠、TLR1-/-小鼠和TLR6-/-小鼠的IL-6釋放，但TLR2-/-小鼠沒有。這些結(jié)果表明是TLR2介導痤瘡丙酸桿菌誘導的細胞活化，而不是TLR4、TLR6或TLR1。本次結(jié)果顯示P.acnes組TLR2的表達較空白組高，說明大鼠耳部接種痤瘡丙酸桿菌后TLR2受體表達增高，與Kim J等[3]的結(jié)果一致。P.acnes+ALA-PDT組平均秩和較P.acnes組低，說明5-ALA-PDT治療后大鼠耳部TLR2表達減少。

3.2 髓樣分化因子（MyD88）：MyD88是Toll樣受體信號通路的一個關鍵的銜接分子，在上游信息傳遞和疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。MyD88結(jié)構(gòu)上有3個功能區(qū)域：N-端死亡區(qū)，中間區(qū)域和C末端區(qū)的Toll區(qū)。Toll區(qū)類似于IL-1受體的胞質(zhì)區(qū)，通過招募連接蛋白來轉(zhuǎn)導信號[8]。實驗結(jié)果表明激動劑可通過激動TLR2激活MyD88。P.acnes+ALA-PDT組較P.acnes組低，說明5-ALA-PDT治療后大鼠耳部MyD88表達減少，然而下游信號仍有待進一步研究。

3.3 巨噬細胞CD68、CD163的表達：巨噬細胞可以清除衰老的宿主細胞和分子，在抵抗感染中也起著重要作用[9]，這是在炎癥過程中的關鍵角色之一，主要是在以下幾個方面：炎癥周圍高濃度趨化因子可誘導巨噬細胞活化，并使巨噬細胞向感染部位募集，激活的巨噬細胞進一步分泌IL-8等因子，引起更多的巨噬細胞活化募集，釋放促炎細胞因子如IL-6和前列腺素等炎癥介質(zhì)，誘導并加重局部炎癥反應[10]。CD68、CD163可以作為M2型巨噬細胞活化的重要的標志物[11]。本次P.acnes組CD68的表達較空白組高，說明大鼠耳部接種痤瘡丙酸桿菌后CD68表達增高，和Kim J等[3]的結(jié)果一致。P.acnes+ALA-PDT組平均秩和較P.acnes組低，說明5-ALA-PDT治療后大鼠耳部炎癥減輕。且P.acnes組CD163的表達較空白組高，說明大鼠耳部接種痤瘡丙酸桿菌后CD163表達增高，和Kim J等[3]的研究結(jié)果一致，且5-ALA-PDT治療后表達降低。

3.4 TLR2激動劑Pam3CysSK4：Pam3CysSK4是一種合成的細菌脂肽，是TLR2的特異性激動劑。已有研究證實TLR2激動劑Pam3CysSK4可以增加CD8+T細胞數(shù)量并加速炎癥進程[12]。采用TLR2的激動劑Pam3CysSK4來干預大鼠耳部，以了解TLR2信號通路在體內(nèi)的作用。實驗結(jié)果表明：TLR2激動劑Pam3CysSK4刺激TLR2表達增多，可能會進一步加劇大鼠耳部炎癥細胞的浸潤。這些結(jié)果進一步證明了這條通路在痤瘡的發(fā)病中的作用。

綜上所述，大鼠耳部毛囊皮脂腺及周圍可少量表達TLR2，接種痤瘡丙酸桿菌后，表達顯著增加，導致巨噬細胞等免疫細胞向毛囊皮脂腺周圍聚集。5-ALA-PDT治療后TLR2表達減少，減弱機體對細菌的免疫反應，從而減輕炎癥。TLR2可調(diào)節(jié)免疫反應，為尋常痤瘡治療提供了一種特異性靶點。這些發(fā)現(xiàn)可能會促進治療尋常痤瘡新藥物的研發(fā)。

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[收稿日期]2017-12-20 [修回日期]2018-05-02

編輯/朱婉蓉