謝利紅 王夢琳 唐安洲

1 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(南寧 530021)

噪聲暴露、環(huán)境因素、藥物毒性或年齡老化等均可導致耳蝸毛細胞損傷，并繼發(fā)螺旋神經(jīng)節(jié)細胞損傷，成年哺乳動物毛細胞損傷后無自發(fā)再生能力可導致永久性的感音神經(jīng)性聾[1～3]。近年來國內(nèi)外學者對于激活內(nèi)耳相關(guān)通路、誘導內(nèi)耳感覺前體細胞(部分具有增殖能力的支持細胞亦稱感覺前體細胞)或干細胞重新進入細胞周期，增殖、分化為毛細胞，使聽力或前庭功能恢復(fù)的研究成為熱點[4]，毛細胞再生有望成為聽力恢復(fù)的理想治療方法。本文就內(nèi)耳毛細再生及其信號通路等研究進行綜述。

1 哺乳動物內(nèi)耳毛細胞再生的現(xiàn)狀

在胚胎發(fā)育的早期，外胚層增厚形成耳板，耳板內(nèi)陷后逐漸形成聽覺和前庭系統(tǒng)[5, 6]。在內(nèi)耳的發(fā)育形成過程中毛細胞與支持細胞擁有共同的祖細胞。在非哺乳脊椎動物中(如鳥類和禽類)毛細胞損傷后可由其鄰近的支持細胞通過有絲分裂增殖、分化為新的毛細胞而恢復(fù)聽力[7]。與非哺乳脊椎動物不同，成年哺乳動物的毛細胞損傷缺失后不能自發(fā)產(chǎn)生新的毛細胞，從而導致永久性聽力障礙。通過體外誘導新生哺乳動物的內(nèi)耳感覺前體細胞、干細胞，可以將其分化為毛細胞樣細胞；研究人員分別從耳蝸Corti器、大上皮脊(GER)、小上皮脊(LER) 前庭球囊和橢圓囊感覺上皮[8～10]、三個半規(guī)管的壺腹脊等不同組織中均分離得到了內(nèi)耳干細胞[11]。

Li等[10]將內(nèi)耳干細胞接種在多聚賴氨酸預(yù)先處理好的培養(yǎng)皿中，貼壁無血清培養(yǎng)，14天之后基因檢測表明分化之后的細胞表達毛細胞標志物MyosinⅦ和Bm3c。Oshiima等[11]對分化后的毛細胞進行電生理檢測，顯示該細胞可產(chǎn)生電壓依賴性電流。Li等[10]研究還發(fā)現(xiàn)內(nèi)耳干細胞在體外具有分化為毛細胞之外的多分化潛能。

在新生哺乳動物耳蝸Corti器中分離出感覺前體細胞，如：少量Lgr5+Axin2+前體細胞具有有限的毛細胞再生能力[12, 13]。Oshima等[11]通過培養(yǎng)新生小鼠 Corti器中的干細胞發(fā)現(xiàn)其可分化成為具有多種毛細胞標記物的細胞，但是在小鼠出生2～3周后耳蝸中的干細胞數(shù)量明顯減少。氨基糖苷類藥物損傷體外培養(yǎng)新生鼠的毛細胞后，通過誘導部分干細胞可分化成為未成熟毛細胞[14]。新生毛細胞主要位于內(nèi)生毛細胞周圍，基底膜外側(cè)出現(xiàn)Tuj1(+) 標記神經(jīng)再支配[15]。成年哺乳動物毛細胞損傷后不能自發(fā)產(chǎn)生新的毛細胞，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)耳受損區(qū)旁的毛細胞、支持細胞、多能干細胞等在一定條件誘導下可能是毛細胞再生的來源，Walters等[16]在敲除p27Kip1基因的噪聲性聾模型成年鼠中，發(fā)現(xiàn)異位Aloh1的表達增加，受損毛細胞周圍的支持細胞可以產(chǎn)生新的毛細胞。White等[17]研究顯示，氨基糖苷類藥物損傷成熟哺乳動物毛細胞后，通過體外培養(yǎng)內(nèi)耳感覺上皮，發(fā)現(xiàn)支持細胞具有轉(zhuǎn)化為未成熟毛細胞的潛能。

2 內(nèi)耳毛細胞再生的信號調(diào)控機制

近年來，在對雞、斑馬魚或鼠等動物毛細胞再生的研究后認為，部分支持細胞具有感覺前體細胞作用，能被誘導增殖并分化為毛細胞，其分化再生為毛細胞主要通過兩種途徑：一種是感覺前體細胞經(jīng)誘導激活后重新進入細胞周期，通過有絲分裂增殖、進一步分化成為毛細胞及支持細胞; 另一種則是通過直接分化的途徑而再生成為毛細胞[18]。感覺前體細胞的增殖和分化過程受各種相關(guān)的信號通路調(diào)控，近年來研究比較多的通路包括Wnt信號通路、Noth信號通路、BMP/Smad、FGF、IGF和Shh信號通路等[6, 19～21]。這些信號通路在胚胎時期毛細胞發(fā)育和分化形成的多個環(huán)節(jié)中起重要調(diào)控作用，可對一些細胞周期調(diào)控因子進行調(diào)控。而在成年哺乳動物內(nèi)耳中這些信號通路會出現(xiàn)改變，此可能是使毛細胞損傷后無再生能力的重要原因。目前研究最多的是Notch信號通路及Wnt信號通路，兩者均是復(fù)雜和高度保守的信號通路，在內(nèi)耳細胞的增殖、遷移、細胞極性、神經(jīng)形成和干細胞的多態(tài)性中起作用。

2.1Wnt信號通路在內(nèi)耳毛細胞再生中的調(diào)控作用 Wnt信號通路包括經(jīng)典Wnt /β-catenin通路和非經(jīng)典Wnt 信號通路，其中非經(jīng)典Wnt 信號通路主要包括：Wnt/平面細胞極性通路、Wnt/PCP信號通路和Wnt/calcium信號通路[12, 22, 23]。

經(jīng)典Wnt /β-catenin通路包括Wnt配體與細胞膜表面的Frizzled受體和LRP5 / 6受體的耦合，激活Dash蛋白導致Axin2/ GSK3β/ APC復(fù)合體的解體，β-catenin 蛋白的釋放進入細核內(nèi)，與T細胞因子(T cell factor / lymphoid enhancerfactor, TCF/LEF)相互作用(圖1)，調(diào)節(jié)靶基因(如Atoh1、Axin2、Lgr5等)的表達。在Wnt 信號沒有激活時，β-catenin 在內(nèi)耳細胞內(nèi)維持很低的水平，當Wnt信號通路激活時，β-catenins水平增加。Wnt/β-catenin抑制劑可以減少胚胎耳蝸感覺前體細胞的增殖，相反使用LiCl等Wnt/β-catenin活化劑可引起Sox2陽性表達的內(nèi)耳前體細胞和毛細胞數(shù)量的增加[7]。在敲除β-catenin的轉(zhuǎn)基因鼠中，前體細胞則停止分化，毛細胞數(shù)量減少，其下游的靶基因Atoh1的表達也會明顯減少。Wnt/PCP信號通路調(diào)節(jié)耳蝸再生毛細胞表面的纖毛束的形成和方向，與毛細胞的外形和Corti器的形狀有關(guān)。

Wnt/PCP信號通路參與毛細胞再生的機制目前尚未明確，其受GTP酶RhoA和Ras的調(diào)節(jié)，RhoA和Ras可激活JNK(c-Jun氨基末端激酶，c-Jun N-terminal kinase，又稱為應(yīng)激活話蛋白激酶)和ROCK(Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶,Rho associated coiledeoil forming protein kinase，ROCK)，引起細胞骨架重排，導致細胞形態(tài)改變。在Wnt/calcium 信號通路中，Wnt 配體和Fzd受體結(jié)合可引起鈣離子的釋放，促使鈣離子依賴性酶類的激活，該通路與胚胎發(fā)育階段的細胞運動和體軸建立有關(guān)[24, 25]。

在Wnt信號通路中，與哺乳動物內(nèi)耳發(fā)育過程有關(guān)的主要有經(jīng)典Wnt/β-catenin和Wnt/PCP 信號通路，到目前為止，未發(fā)現(xiàn)Wnt/calcium 信號通路在內(nèi)耳發(fā)育過程中有明顯的作用。經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號通路主要在內(nèi)耳發(fā)育早期起作用，自E12.5(胚胎12.5天)起，主要參與感覺上皮區(qū)域細胞命運的決定；Wnt/PCP 信號通路則在毛細胞靜纖毛的排列和蝸管的延伸過程中起著重要作用[26]。

2.2Notch信號通路在內(nèi)耳毛細胞再生中的調(diào)控作用 研究表明 Notch信號負性調(diào)節(jié)內(nèi)耳感覺前體細胞的增殖，并維持耳蝸感覺上皮細胞數(shù)量和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)態(tài)[20]。Notch信號轉(zhuǎn)導不需蛋白激活和第二信使的參與,可通過細胞表面的受體，直接接收鄰近細胞的信號并傳導至細胞核，激活細胞核內(nèi)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達。在哺乳類動物的聽覺感受上皮中Notch信號通路的受體主要是Notchl,配體主要為Deltal、Jagged1和Jagged2[6, 27]，當鄰近細胞表面的配體結(jié)合Notch蛋白后，Notch信號被激活，由γ-secretase酶水解、切割Notch跨膜區(qū)，釋放Notch的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(notch intracellular domain，NICD)，并被轉(zhuǎn)運到到細胞核中，與CSL家族(CBF1、SuH、Lagl)轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，誘導一系列基因的轉(zhuǎn)錄(圖2)。Notch信號中Jagged 1的缺失會導致Sox2 and P27kip1陽性的感覺前體細胞減少，從而引起毛細胞數(shù)量的減少[6]。

圖1 經(jīng)典Wnt信號通路示意圖(圖片摘自Chai R. et al.[12])

Notch信號通路在內(nèi)耳中具有橫向誘導和橫向抑制的作用，橫向誘導是在相鄰感覺前體細胞Notch信號受體和配體形成中正反饋環(huán)路。在毛細胞和支持細胞分化的早期橫向誘導起主要作用，而在毛細胞和支持細胞分化晚期則是橫向抑制起主要作用[27]。成年鼠中Notch信號能抑制感覺前體細胞分化為毛細胞，但是在內(nèi)耳損傷后，該信號通路可再次被激活而具有促進毛細胞再生的潛在能力；如：在噪聲引起毛細胞損傷的動物模型中，γ-分泌抑制劑(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨?；?L-2苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)能抑制Notch信號通路引起Atoh1的轉(zhuǎn)錄上調(diào)而觸發(fā)毛細胞的再生；在成年鼠中，耳毒性藥物耳蝸損傷后可引起Notch信號通路的活化[28～30]。

Wnt信號通路可以正向調(diào)節(jié)Notch信號通路中Jagged1、 Notch1和Hes1的表達[10, 31]。Wnt信號和Notch信號通路在耳蝸發(fā)育中相互影響激活Wnt信號通路，聯(lián)合使用γ-分泌抑制劑DAPT能誘導耳蝸感覺前體細胞分化成毛細胞。Wnt和Notch信號在耳蝸發(fā)育中的相互影響的具體機制還需進一步的研究[32]。

圖2 Notch信號通路在內(nèi)耳毛細胞再生中的調(diào)控機制(圖片摘自Waqas Muhammad, et al[6])

2.3與內(nèi)耳毛細胞再生的細胞周期調(diào)控有關(guān)的細胞因子 細胞周期調(diào)控蛋白在哺乳動物內(nèi)耳發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用，主要與內(nèi)耳感覺前體細胞的產(chǎn)生、增殖并分化為毛細胞的調(diào)控過程有關(guān)。這些細胞周期調(diào)控因子包括正性調(diào)控因子和抑制因子，兩者相互協(xié)調(diào)共同調(diào)控毛細胞的產(chǎn)生、分化和成熟。細胞周期正性調(diào)控因子有cyclinD1、cyclinA2、Skp2，細胞周期抑制因子包括：Rb的上游分子(如：p27Kip1、p57Kip2、p19Ink4d和p21Cip1)；Rb蛋白(如：Rb、p107和p130)；Rb下游分子(如：E2Fs)[33, 34]；其中Rb蛋白在促進耳蝸前體細胞退出細胞周期方面起到關(guān)鍵作用[35]。在鼠E13.5的ZNPC區(qū)域，前體細胞可分化成毛細胞或支持細胞[36]，而在Rb基因敲除的野生型胚胎鼠中，E10.5的ZNPC區(qū)域(zone of nonproliferating cells非增殖區(qū)域)仍包含BrdU(+)的細胞，前體細胞池增殖擴大，內(nèi)耳前體細胞不能退出細胞周期，進一步分化成多余的毛細胞和支持細胞[33，35, 36]。另外，Rb蛋白可直接或間接參與細胞分化期間基因表達的調(diào)控，R6基因是保持毛細胞有絲分裂后狀態(tài)的關(guān)鍵因子。目前為止，對于調(diào)控P27轉(zhuǎn)錄的上游分子尚不清楚，可能與Notch1、Sox2和Jag1的調(diào)控有關(guān)[37]。

3 結(jié)語

綜上所述，在內(nèi)耳發(fā)育的過程中，Wnt、Notch信號等通路及與細胞周期調(diào)控有關(guān)的細胞因子在調(diào)控支持細胞和毛細胞的分化和發(fā)育過程中起到非常重要的作用。雖然內(nèi)耳感覺前體細胞在體外可以誘導分化為毛細胞，但是新生的毛細胞是否具有體內(nèi)毛細胞的功能和特性還需要進一步的研究。Zhang[8]和Zhai等[38]分別從新生小鼠LER和GER區(qū)域分離得到內(nèi)耳感覺前體細胞，并將其與橢圓囊間充質(zhì)細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)可以明顯提高內(nèi)耳感覺前體細胞分化為毛細胞的比例。內(nèi)耳干細胞所處的微環(huán)境以及與鄰近細胞的相互作用對于內(nèi)耳干細胞、感覺前體細胞誘導分化為成熟的內(nèi)耳毛細胞至關(guān)重要。但是到目前內(nèi)為止，內(nèi)耳干細胞、感覺前體細胞分化為毛細胞的效率較低。因此，未來的研究應(yīng)該致力于建立高效安全的誘導體系，誘導形成成熟并具有功能的毛細胞。此外各信號通路及細胞調(diào)控因子之間是如何進行分工及精確調(diào)控的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系還需要進一步的深入研究。