宋啟東,涂宗財,2,*,王 輝,張 露,楊文華,鐘比真,陸建偉

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江西南昌 330047; 2.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江西南昌 330022)

雞蛋具有低廉的價格和很高的營養(yǎng)價值,已成為國民健康飲食的重要部分。因其具有優(yōu)良的功能性而常作為原料、輔料、添加劑等應(yīng)用于面類、肉類、休閑類食品的加工中[1]。但作為高蛋白食物,雞蛋還是引起青少年和兒童過敏的主要過敏源,且大部分的雞蛋過敏反應(yīng)都是由蛋清中的蛋白所引起的[2-3]。所以,隨著雞蛋消耗量的持續(xù)增加和應(yīng)用范圍的不斷推廣,雞蛋過敏率也有逐年遞增的趨勢,使得對雞蛋(尤其是蛋清)致敏性的研究愈發(fā)得到重視[4]。

表1 雞蛋過敏患者病史Table 1 Clinical history of egg allergy patients’ sera

目前,對雞蛋改性的研究仍集中在功能性質(zhì)上,而關(guān)于降低致敏性的改性研究較少，且主要是對蛋清中純蛋白的研究。熱處理是一種簡單的降低食物過敏的方法,蛋白加熱變性后原始的三級結(jié)構(gòu)被破壞,使許多天然抗原被修飾。Shin等[5]發(fā)現(xiàn)熱處理后卵類黏蛋白致敏性增加,卵清蛋白致敏性減少,溶菌酶和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的致敏性完全消失;Sicherer等[6]發(fā)現(xiàn)蛋清蛋白煮沸60 min后致敏性顯著降低,95 ℃加熱15 min后,卵清蛋白和卵類黏蛋白的IgE結(jié)合能力降低,但熱處理會破壞蛋白結(jié)構(gòu),形成無規(guī)則卷曲的聚合體,降低溶解性。超聲波作為新興“冷處理”技術(shù)具有耗能少,效率高等優(yōu)點,既可以提高蛋白的功能特性,還能很大程度的保留食品的天然品質(zhì)和營養(yǎng)價值,且易與其他方法聯(lián)合,具有很好的協(xié)同性[7]。糖基化是少數(shù)可直接應(yīng)用于食品加工的化學(xué)方法之一。An等[8]發(fā)現(xiàn)隨著卵清蛋白與羧甲基纖維素糖基化程度的加深,其復(fù)合物的乳化性、泡沫穩(wěn)定性、蛋白熱變性溫度均顯著增強。Seo等[9]發(fā)現(xiàn)溶菌酶與半乳糖、低聚半乳糖、半乳聚糖通過糖基化反應(yīng)不僅可以提高溶解性、熱穩(wěn)定性和乳化穩(wěn)定性,還能有效降低致敏性。復(fù)合改性是通過兩種以上的方法協(xié)同改性蛋白,通過復(fù)合改性尤其是物理-化學(xué)復(fù)合改性,不僅可以互補單一處理方法的不足,還能更好的保持食品風(fēng)味和營養(yǎng),更高效的提高功能性質(zhì)和脫敏效果。

本文擬采用熱處理、糖基化、超聲、超聲預(yù)處理結(jié)合糖基化等方法改性實際生產(chǎn)和生活中常用的蛋清粉,通過對比研究不同改性方法對蛋清粉致敏性和功能性的影響,選出既可以高效降低致敏性又可以有效保留甚至提高其功能性的加工方法,以期為低致敏蛋制品的研發(fā)提供更有實際價值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋清粉 鄭州奧冉化工;人血清(一抗) 美國PlasmaLab International公司;酶標板 美國Corning公司;胃蛋白酶(≥250 U/mg)、羊抗人血清(二抗)、胰酶 美國Sigma公司;大豆油 益海嘉里集團;脫脂奶粉 雀巢公司;鄰苯二甲醛(OPA) 美國Sigma公司;其他試劑 均為常用分析純。

JY98-IIIDN型超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;HF2000型酶標儀 北京華安麥科;電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海恒科學(xué)儀器有限公司;Leader-A1型超純水儀 上海領(lǐng)德儀器有限公司;冷凍干燥機 北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司;IKA T18型分散機 艾卡儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 蛋清粉用pH8.0磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋到10 mg/mL,離心后取上清液(U0)100 mL,再分別進行如下操作:

加熱處理(C1):凍干處理后,在75%相對濕度條件下,70 ℃加熱4 h;

糖基化(C2):按蛋清粉:糖質(zhì)量比1∶8加入葡萄糖,凍干后在75%相對濕度條件下,70 ℃反應(yīng)4 h;

超聲(C3):冰水浴中600 W超聲15 min,再凍干處理;

超聲預(yù)處理結(jié)合糖基化(C4):冰水浴中600 W超聲15 min,再按蛋清粉∶糖質(zhì)量比1∶8加入葡萄糖,凍干后在75%相對濕度條件下70 ℃反應(yīng)4 h;

模擬體外消化[10](C5):按C4處理后,加超純水復(fù)溶至10 mg/mL,用1 mol/L HCl將pH調(diào)至2.0,37 ℃預(yù)熱10 min,按酶∶底物質(zhì)量比1∶50加入胃蛋白酶,37 ℃酶解3 h。用1 mol/L NaOH將pH調(diào)至7.5終止反應(yīng),37 ℃預(yù)熱10 min,按酶∶底物質(zhì)量比1∶50添加胰酶,37 ℃,3 h,煮沸10 min,凍干。

1.2.2 自由氨基含量測定 參考Nielsen等[11]的方法。將樣品用pH8.0的PBS稀釋成40 mg/mL,取10 μL樣品或不同濃度(0～0.8 mg/mL)賴氨酸與200 μL OPA試劑避光反應(yīng)2 min,340 nm測吸光值,通過標曲得到樣品自由氨基含量。

1.2.3 過敏原性測定 通過間接ELISA進行測定。每孔加入100 μL 100 μg/mL樣品(或原樣),4 ℃包被過夜,洗板,拍干;加250 μL 5%脫脂奶粉進行封閉,37 ℃,1 h,洗板,拍干;加100 μL人血清,37 ℃,1 h,洗板,拍干;加100 μL二抗,37 ℃,1 h,洗板,拍干;加100 μL顯色液,37 ℃,15 min;加100 μL H2SO4,450 nm測吸光值。

式中:A0:一抗為患者血清所測得的未處理樣品吸光度與一抗為未對雞蛋過敏的人血清所測得的未處理樣品吸光度的差值;A1:一抗為患者血清所測得的處理后樣品吸光度與一抗為未對雞蛋過敏的人血清所測得的處理后樣品吸光度的差值。

1.2.4 溶解性測定 用PBS將樣品稀釋為2 mg/mL并與考馬斯亮藍染液按體積比1∶5混合,靜置5 min,595 nm測吸光值。以牛血清蛋白標品(0～100 μg/mL)的濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標作標曲,根據(jù)標曲計算得出可溶性蛋白含量[12]。

1.2.5 乳化性及其穩(wěn)定性的測定 參考Zhao等[13]的方法加以調(diào)整。將樣品用PBS稀釋成4 mg/mL,按樣品:大豆油質(zhì)量比3∶1加入大豆油,11000 r/min均質(zhì)2 min,迅速從底部吸取乳液與0.1% SDS，按1∶50體積比混勻后在500 nm測吸光值;10 min后重新從底部吸取乳液與0.1% SDS，按體積比1∶50混勻后在500 nm處測定吸光值。

式中:DF為稀釋因子(50);c為樣品初始濃度(4 mg/mL);t為穩(wěn)定時間(10 min);A0為0 min時吸光值;A10為10 min后吸光值。

1.2.6 抗氧化活性測定

1.2.6.1 還原力測定 將樣品(25 mg/mL)、PBS(0.2 mol/L,pH6.6)、K3[Fe(CN)6](1%)等體積混合,50 ℃反應(yīng)20 min,冰水浴冷卻,取300 μL混合液與100 μL三氯乙酸(10%)混合,離心5 min后取200 μL上清液與40 μL三氯化鐵(0.1%)50 ℃反應(yīng)10 min,700 nm測定吸光值[14]。

1.2.6.2 亞鐵離子螯合能力測定 將樣品(25 mg/mL)、FeCl2(2 mmol/L)、菲洛嗪溶液(5 mmol/L)按體積比1∶1∶2依次加入,靜置10 min,562 nm測吸光值[14]。

式中:A0為PBS替代樣品測得的吸光值;A1為樣品測得的吸光值。

1.2.6.3 DPPH·清除力測定 將樣品(25 mg/mL)和DPPH(0.1 mmol/L溶于乙醇)按體積比1∶1混合,反應(yīng)20 min,517 nm測定吸光值[15]。

式中:A0為PBS替代樣品測得的吸光值;A1為樣品測得的吸光值。

1.2.6.4 ABTS+·清除力測定 將ABTS(7 mmol/L)與過硫酸鉀(2.45 mmol/L)等體積混勻,室溫暗反應(yīng)16 h,將混合液用PBS稀釋至在734 nm的吸光值為0.70±0.02,將稀釋后的工作液避光0.5 h,取100 μL 25 mg/mL的樣品與3.9 mL工作液混合,避光反應(yīng)10 min后在734 nm測定吸光值[15]。

式中:A0為PBS替代樣品測得的吸光值;A1為樣品測得的吸光值。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 Origin 9.0作圖,SPSS 17.0分析顯著性(p<0.05),平行實驗至少三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 自由氨基含量分析

自由氨基含量可以很好的反映蛋白結(jié)構(gòu)變化和糖基化程度。由圖1可知，與原樣(U0)相比,熱處理和超聲改性的樣品自由氨基含量顯著(p<0.05)增加。這可能是因為熱處理使蛋白解離,二、三級結(jié)構(gòu)改變,導(dǎo)致大量的氨基產(chǎn)生和暴露[16];而超聲主要通過空化作用提供特殊物理環(huán)境，舒展蛋白的空間結(jié)構(gòu),但不能有效改變蛋白低級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生氨基,所以自由氨基含量低于熱處理[17];糖基化改性后,樣品發(fā)生羰胺縮合使自由氨基含量顯著(p<0.05)降低,而且糖基化形成的糖蛋白還可以維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,減少因結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的氨基暴露[18];復(fù)合改性后自由氨基含量進一步降低,說明盡管超聲使蛋白結(jié)構(gòu)展開,暴露了部分內(nèi)部氨基,但也減小了空間位阻[19]促進了糖基化反應(yīng)的進行,這也說明相比于超聲,自由氨基含量主要受糖基化影響;將復(fù)合處理的樣品進行體外消化后,蛋白通過酶解使肽鍵斷裂,次級結(jié)構(gòu)被破壞,大量氨基產(chǎn)生和暴露,自由氨基含量顯著(p<0.05)升高。

圖1 改性方法對蛋清粉自由氨基的影響Fig.1 Effect of different modification methods on the free aminos of egg white powder注：不同小寫字母表示不同改性方法之間 差異顯著(p<0.05);圖2～圖5同。

2.2 過敏原性分析

不同患者IgE水平和IgE識別的過敏表位不同,如卵白蛋白的某些線性表位會被長期雞蛋過敏患者識別,但不會被短期患者識別[20]。熱處理主要破壞蛋白的空間結(jié)構(gòu),而蛋清蛋白的過敏表位以線性表位為主[21],并且熱處理在破壞構(gòu)象表位的同時,也可能產(chǎn)生新的構(gòu)象表位,暴露更多的線性表位,所以致敏性總體上是增加的,最高增加了12.77%(P2)。超聲使蛋白結(jié)構(gòu)舒展,更多的線性表位暴露甚至增加新的構(gòu)象表位[22],而熱處理能一定程度的解離蛋白低級結(jié)構(gòu),還能使蛋白卷曲聚集[5],這可以一定程度的修飾過敏表位,所以超聲處理后樣品致敏性增加程度更大,為20.84%(P2)。糖基化既可以通過外接糖分子阻塞線性表位,又可以改變蛋白結(jié)構(gòu)修飾構(gòu)象表位,使致敏性顯著(p<0.05)降低[23],最大降低了29.08%(P4)。復(fù)合改性后,超聲使蛋白結(jié)構(gòu)展開,更多的過敏表位暴露在蛋白表面,但也減小了空間位阻并暴露出了更多的結(jié)合位點促進糖基化反應(yīng)進行,抗原表位得到更全面的修飾,致敏性進一步降低,為43.9%(P4);模擬體外消化后樣品的致敏性更大程度的降低,這是因為酶解可以使肽鍵大量斷裂,更多的線性表位得到修飾,但酶解不能針對性的打斷線性表位并且可能形成新的表位[24],所以經(jīng)體外消化后的致敏性降低程度不大,最高降低了52.76%(P2)。聯(lián)系自由氨基含量的變化我們可以發(fā)現(xiàn),消化可以高效酶解蛋白,破壞線性表位,但并不會破壞糖基化產(chǎn)物對蛋白致敏性的修飾。

圖2 改性方法對蛋清粉致敏性的影響Fig.2 Effects of different modification methods on the immunogenicity of egg white powder注：P1～P4為不同患者血清。

2.3 溶解性分析

溶解性是蛋白最關(guān)鍵的理化性質(zhì)。熱處理后蛋白溶解性降低,這主要是因為蛋白共價交聯(lián)發(fā)生聚集,結(jié)構(gòu)變化使疏水基團暴露導(dǎo)致表面疏水性增加[25];超聲可使蛋白結(jié)構(gòu)舒展,大量的疏水基團暴露[22]使溶解性也發(fā)生降低,但不會影響蛋白的聚集狀態(tài)所以溶解性高于熱處理;糖基化通過大量接入親水基團提高蛋白親水性,使溶解性顯著增加(p<0.05);相比于原樣,復(fù)合改性后溶解性提高了0.06751 mg/mL,這是因為超聲預(yù)處理會展開蛋白結(jié)構(gòu),盡管會暴露更多的疏水基團,但也促進了糖基化反應(yīng)的進行，使蛋白結(jié)合更多的親水基團,溶解性進一步增加;再經(jīng)體外消化后,蛋白被酶解成多肽,增加了親水基團與外部水環(huán)境的接觸,溶解性進一步增加。

圖3 改性方法對蛋清粉溶解性的影響Fig.3 Effect of different modification methods on the solubility of egg white powder

2.4 乳化性及其穩(wěn)定性分析

蛋白的乳化性是食品加工的重要功能性質(zhì)之一,主要與溶解性、表面疏水性、表面電荷、分子柔性有關(guān)[17]。熱處理后樣品的乳化性降低,乳化穩(wěn)定性沒有顯著變化,這是因為熱處理可以通過改變蛋白的粒徑、二級結(jié)構(gòu)和表面疏水性來影響乳化性能[25],蛋白經(jīng)熱處理后分子發(fā)生共價交聯(lián)形成聚集體,大量基團被掩埋,最終導(dǎo)致乳化性降低[6];超聲處理可以展開蛋白結(jié)構(gòu)且不發(fā)生聚集,內(nèi)部基團大量暴露,所以盡管溶解性降低,但分子柔性和表面疏水性的增加仍會使乳化性提高,而且超聲可以降低粒徑并使粒徑更均一[26-27],利于蛋白在油-水界面穩(wěn)定擴散,顯著增加穩(wěn)定性(p<0.05);糖基化通過外接親水基團在蛋白表面形成大量的親水層,蛋白可以提供更多的親水和帶電基團[28],并且糖基化分子更易在油-水界面快速遷移并在油滴表面形成保護膜[29],阻礙油滴重新聚集,使乳化性及其穩(wěn)定性顯著增加(p<0.05);復(fù)合改性既可以通過超聲增加疏水性又可以通過糖基化增強親水性,并且超聲預(yù)處理展開蛋白結(jié)構(gòu)可以促進更多的糖與未糖基化蛋白結(jié)合,溶解性、表面電荷、表面疏水基團的進一步增加[27,29],使乳化性和乳化穩(wěn)定性分別提升了38.18 m2/g、8.174 min。

圖4 改性方法對蛋清粉乳化性能的影響Fig.4 Effect of different modification methods on the emulsion of egg white powder

2.5 抗氧化活性分析

同種物質(zhì)在不同評價體系中抗氧化能力不同,所以我們通過四種指標來評價樣品抗氧化能力。蛋白抗氧化活性與其空間結(jié)構(gòu)、芳香族和含硫氨基酸中親水性殘基有關(guān)[30]。由圖5可知，經(jīng)熱處理和超聲改性后,樣品的還原力、亞鐵離子螯合能力與未處理原樣相比沒有顯著(p>0.05)差異,而對DPPH·和ABTS+·的清除能力略有降低,這說明只改變蛋白結(jié)構(gòu)的物理手段不能有效增強蛋白的供電子能力,而且蛋白溶解性降低還會使電子供體減少導(dǎo)致抗氧化能力降低;糖基化后的樣品抗氧化活性均有提升,這是因為糖基化產(chǎn)物的生成、降解、聚合(如還原酮類、雜環(huán)類化合物等中間產(chǎn)物)以及焦糖化反應(yīng)均有助于提高蛋白的抗氧化活性[31-32],DPPH·、ABTS+·等可以接受這些產(chǎn)物中抗氧化基團的氫原子以達到穩(wěn)定狀態(tài),而且蛋白溶解性

圖5 改性方法對蛋清粉抗氧化活性的影響Fig.5 Effects of different modification methods on the antioxidant activity of egg white powder

的增加也促進了抗氧化基團與自由基的接觸,抗氧化活性進一步增強;復(fù)合改性過程中,超聲使結(jié)構(gòu)充分展開,更多氨基的暴露加速了糖基化反應(yīng),進一步增加了抗氧化物質(zhì)的生成,提供更多的電子穩(wěn)定自由基中斷氧化反應(yīng)的進行,最終使還原力、亞鐵離子螯合能力、DPPH·和ABTS+·清除能力分別提升了1.133、57.22%、54.92%、34.55%;再經(jīng)體外消化后,蛋白斷裂成低分子肽,暴露更多的酪氨酸、色氨酸等抗氧化殘基,釋放更多的具有抗氧化能力的生物活性肽[33],并且溶解性的進一步增強也使抗氧化產(chǎn)物更易與自由基結(jié)合,樣品的抗氧化活性顯著增強(p<0.05)。

3 結(jié)論

70 ℃熱處理4 h總體上會使蛋清粉致敏性增加,最高增加了12.77%,同時溶解性、乳化性能、抗氧化活性均出現(xiàn)不同程度降低;600 W冰水浴超聲15 min后蛋清粉的致敏性增加程度更大,為20.84%,而乳化性能略有升高,但溶解性、抗氧化活性均降低;70 ℃糖基化改性4 h后致敏性顯著降低(p<0.05),最大降低了29.08%,并且溶解性、乳化性能、抗氧化活性均有提升;復(fù)合改性后樣品的致敏性降低程度更大,為43.9%,功能性也得到更大改善,溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、還原力、亞鐵離子螯合能力、DPPH·和ABTS+·清除能力相比原樣分別提高了0.06751 mg/mL、38.18 m2/g、8.174 min、1.133、57.22%、54.92%、34.55%;復(fù)合改性再經(jīng)體外消化后,樣品的致敏性進一步降低,同時溶解性和抗氧化活性均有更大程度的提升。以上研究表明熱處理不適合蛋制品加工,超聲改性只適于開發(fā)高乳化性蛋制品,而糖基化和復(fù)合改性既可以有效降低致敏性,還能提高功能性,所以可用于蛋制品加工。并且復(fù)合改性的作用效果更顯著,且復(fù)合改性后再經(jīng)消化仍能很好的保持甚至提高產(chǎn)品品質(zhì),所以復(fù)合改性是蛋制品加工生產(chǎn)的最佳方法。