兩種酪胺磁性分子印跡聚合物的 制備及比較

張 燦,于芳芳,師曉漫,于欣欣

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

酪胺(Tyramine，TM)是酪氨酸在氨基酸脫羧酶的作用下產(chǎn)生的一種含氮低分子生物胺[1]。生物胺廣泛存在于各種食品中,如酒類、調(diào)味品(醋和醬油)中。酪胺濃度過高時不僅會影響食品的風(fēng)味,而且還導(dǎo)致心律加快,引發(fā)偏頭疼等問題[2],此外含量的高低也被用于判斷食品的新鮮程度。目前常用的檢測生物胺的方法主要有薄層色譜[3]、高效液相色譜[4]等方法。但這些方法成本較高,在檢測前都需要進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理,效果不太理想。然而,由于食品基質(zhì)的復(fù)雜性和分析物的低濃度,分離和富集酪胺是樣品預(yù)處理步驟的關(guān)鍵。

分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymers,MIPs)是對模板分子具有高度選擇性的人造多孔材料[5]。因為其化學(xué)穩(wěn)定性以及成本低等優(yōu)點,已被廣泛應(yīng)用于固相萃取和傳感器等諸多領(lǐng)域[6-7],但傳統(tǒng)的分子印跡聚合物也存在模板分子泄漏,傳質(zhì)速度慢,分離過程復(fù)雜等缺點[8]。

本文采用表面分子印跡和磁性納米技術(shù)相結(jié)合的方法,選擇羧甲基葡聚糖包被的磁性納米粒子(CM-Fe3O4)作為載體,酪胺作為模板分子,成功制備了酪胺的磁性分子印跡聚合物(dex-MMIPs),對酪胺具有良好的吸附能力。同時以硅烷偶聯(lián)劑修飾的磁性納米粒子(Fe3O4@SiO2-MPS)為載體合成了MPS-MMIPs,通過吸附實驗比較這兩種印跡聚合物的性能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酪胺(Tyramine,TM)、煙酰胺(Nicotinamide,VPP)(如圖1所示)、六水合氯化鐵、四水合氯化亞鐵和葡聚糖(MW 20000) 購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(中國上海);甲基丙烯酸(MAA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA,純度>98%)、3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(3-methacryloxypropyltrimethoxysilane,MPS) 購自J&K Chemicals(中國上海),所有試劑均為分析級。

HH-A數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州市英格爾儀器制造有限公司;傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Scientific公司;UV-1801紫外/可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備羧基化葡聚糖修飾的Fe3O4磁性納米粒子(CM-Fe3O4) 葡聚糖包覆磁性納米粒子的制備采用共沉淀法[9]。將4 g葡聚糖和2 g六水合氯化鐵溶解在30 mL的去離子水中,加熱攪拌使葡聚糖完全溶解,加入0.8 g四水合氯化亞鐵,15 min后,通入N2保護(hù),迅速加入5 mL氨水,劇烈攪拌。升溫至60 ℃攪拌1 h后,冷卻至室溫,以7000 r/min的速度離心20 min,除去大的團(tuán)聚顆粒。透析袋(MWCO:14000)透析24 h后將得到的葡聚糖修飾的磁流體(dex-Fe3O4)放入250 mL三頸瓶中,加入4 g氫氧化鈉,再緩慢地加入4 g氯乙酸,通N2保護(hù),將混合溶液置于70 ℃水浴中,100 r/min機(jī)械攪拌90 min。反應(yīng)完成后,冷卻至室溫,透析24 h,再放入0.1 moL·L-1的稀鹽酸溶液中透析24 h,最后用去離子水透析24 h,磁流體真空干燥一夜,得到羧基化葡聚糖修飾的Fe3O4磁性納米粒子(CM-Fe3O4)。

1.2.2 制備硅烷偶聯(lián)劑修飾的Fe3O4磁性納米粒子(Fe3O4@SiO2-MPS) 自制Fe3O4(0.5 g)分散在60 mL異丙醇:超純水(5∶1,V/V),超聲20 min。持續(xù)攪拌下,加入10 mL氨水和4 mL四乙氧基硅烷(Tetraethoxysilane,TEOS)。將混合溶液在室溫下攪拌12 h。反應(yīng)結(jié)束后,通過外部磁場收集磁性粒子(Fe3O4@SiO2),用超純水多次洗滌,60 ℃真空干燥24 h。將干燥后的納米粒子分散在含有5 mL MPS的50 mL無水甲苯中,超聲分散15 min后,N2保護(hù)下70 ℃反應(yīng)24 h。磁鐵收集產(chǎn)物,經(jīng)乙醇和去離子水洗滌后干燥備用[10]。

1.2.3 制備酪胺磁性分子印跡聚合物 將模板分子酪胺(0.1 mmol)和功能單體MAA(0.4 mmol)分散在4 mL乙腈中,并將混合物在4 ℃下反應(yīng)12 h,CM-Fe3O4和Fe3O4@SiO2-MPS(100.0 mg)分別加入上述混合液中攪拌2 h,加入交聯(lián)劑EGDMA(2.0 mmol)和引發(fā)劑AIBN(20.0 mg),并用N2吹掃5 min以除去氧氣。然后60 ℃下反應(yīng)24 h。聚合之后,以甲醇-乙酸(9∶1,v/v)為洗脫液索氏提取24 h,再用甲醇洗滌三次,干燥并研磨過篩得到dex-MMIPs和MPS-MMIPs,同時在不存在模板分子的情況下用相同的步驟制備dex-MNIPs(magnetic non-molecularly imprinted polymers)和MPS-MNIPs。

1.2.4 不同磁性載體的印跡聚合物動態(tài)吸附實驗 為了評估制備聚合物的結(jié)合動力學(xué),將20 mg聚合物分散在10.0 mL酪胺-甲醇溶液(5 mg·L-1)中,25 ℃水浴振蕩0、5、10、15、20、25、30、60和90 min。隨后,通過外部磁鐵分離混合物,上清液過0.45 μm濾膜后通過UV在226 nm處測定。吸附容量Q(mg·g-1)用下式計算:

式(1)

式中,C0為酪胺溶液的初始濃度(mg·L-1),C1為吸附后上清液中酪胺濃度(mg·L-1),v為初始酪胺溶液體積(mL),m是聚合物的重量(g)。通過偽二階方程進(jìn)行分析[11],公式如下

式(2)

式中,Qt是t時刻的吸附量(mg·g-1),Qe是平衡時的吸附量(mg·g-1),k二階吸附常數(shù)(mg·g-1·s-1)。

1.2.5 不同磁性載體的印跡聚合物靜態(tài)吸附實驗 為了評估聚合物對酪胺的結(jié)合能力,將20.0 mg聚合物加入到10.0 mL不同濃度(0、1、5、10、15、20、25和30 mg·L-1)的酪胺-甲醇溶液中,25 ℃振蕩20 min。用同樣方法計算吸附量Q(mg·g-1)。并且通過Scatchard模型對吸附結(jié)果進(jìn)行分析,公式如下所示:

式(3)

式中,Qm是最大吸附容量(mg·g-1),Kd是Scatchard常數(shù)。

1.2.6 特異性吸附實驗 將VPP作為TM的結(jié)構(gòu)類似物參與到聚合物的選擇性吸附實驗中。分別取20 mg聚合物加入5 mg·L-1的結(jié)構(gòu)類似物(VPP)溶液中,混合物在25 ℃下振蕩20 min。外部磁鐵分離,過濾并分析計算吸附量。其中兩種化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 結(jié)構(gòu)類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of analogs

2 結(jié)果與分析

印跡聚合物的制備過程如圖2所示。首先,不同功能基團(tuán)修飾的Fe3O4磁性納米粒子的制備,其次是MIPs在磁性粒子表面的聚合,最后用合成的磁性印跡聚合物吸附模板分子。其中CM-Fe3O4通過兩步法合成。第一步通過共沉淀法制備涂覆有葡聚糖的Fe3O4。第二步,Fe3O4表面上的葡聚糖與氯乙酸反應(yīng),在納米粒子表面引入-COONa最后酸化得到-COOH。Fe3O4@SiO2-MPS的合成同樣也是采用兩步法,首先用TEOS使Fe3O4表面涂覆SiO2層,然后通過引入MPS使雙鍵被接枝在Fe3O4@SiO2表面。將得到的兩種不同材料修飾的磁性納米粒子,TM,MAA和EGDMA聚合獲得酪胺的磁性分子印跡聚合物。

圖2 酪胺磁性分子印跡聚合物合成示意圖Fig.2 Schematic illustration of the process for preparation of tyramine magnetic molecularly imprinted polymers

2.1 FT-IR分析

圖3為幾種粒子的紅外譜圖。其中580 cm-1的峰來自Fe-O的振動。圖3a中,1100和800 cm-1附近的峰為Si-O的不對稱伸縮振動和對稱伸縮振動,480 cm-1作為Si-O彎曲振動,表明SiO2成功地修飾Fe3O4磁性納米粒子,同時2977 cm-1表示=CH2的對稱伸縮振動,證明雙鍵已經(jīng)成功的修飾在Fe3O4@SiO2的表面[12]。圖中3(b、c、d)的3400、2927和1013 cm-1處的峰是葡聚糖結(jié)構(gòu)中存在的-OH,-CH2和C-O-C鍵的特征峰。此外,在樣品c中1598 cm-1的峰是羧酸鹽中-CO2的伸縮振動,樣品d中1735 cm-1處的吸收帶歸因于游離羧酸中C=O伸縮振動峰。這說明葡聚糖分子已經(jīng)成功連接到磁性納米粒子表面,并完成羧酸化。

圖3 紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra注:(a):Fe3O4@SiO2-MPS,(b):dex-Fe3O4,

2.2 XRD分析

圖4顯示了(a)Fe3O4、(b)Fe3O4@SiO2-MPS和(c)CM-Fe3O4的XRD圖。在20°～70°范圍內(nèi)有六個相對較強(qiáng)的衍射峰是220°、311°、400°、422°、511°和440°,與JCPDS數(shù)據(jù)庫中的Fe3O4匹配良好(JCPDS卡:19～629)[13]。其中a,b,c三種物質(zhì)的衍射峰并沒有明顯的差別,說明在修飾過程中Fe3O4核心晶體結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生變化。

圖4 聚合物的XRD圖Fig.4 XRD of polymers注:(a):Fe3O4,(b):Fe3O4@SiO2-MPS,(c):CM-Fe3O4。

2.3 TEM分析

通過透射電鏡對合成的磁性粒子進(jìn)行觀察,結(jié)果如圖5所示。dex-Fe3O4(b)與未經(jīng)修飾的Fe3O4(a)相比,分散性更好,粒徑變大,這可能是由于未經(jīng)修飾的Fe3O4因為巨大的表面能導(dǎo)致團(tuán)聚嚴(yán)重,而長鏈葡聚糖分子增加了顆粒之間的空間位阻從而改善磁性納米顆粒的分散性。

圖5 磁性粒子的透射電鏡Fig.5 TEM of magnetic nanoparticles注:(a):Fe3O4,(b):dex-Fe3O4。

2.4 不同磁性載體的印跡聚合物動態(tài)吸附實驗

聚合物對酪胺的吸收動力學(xué)結(jié)果如圖6所示。dex-MMIPs對酪胺的吸附量在前10 min內(nèi)迅速增加,在20 min左右迅速達(dá)到吸附平衡,MPS-MMIPs在60 min左右才能達(dá)到吸附平衡,而很多分子印跡聚合物對目標(biāo)物達(dá)到吸附平衡一般要很長時間,如楊眉等人制備的鏈霉素分子印跡聚合物達(dá)到吸附平衡所需要的時間約為16 h[14],周興農(nóng)等[2]制備的酪胺分子印跡聚合物吸附平衡需要8 h。同時我們制備的MPS-MMIPs的吸附量明顯低于dex-MMIPs,可能是葡聚糖的表面含有大量的活性基團(tuán),增加了有效印跡位點的形成,此外傳質(zhì)效率的提高,也有助于模板分子的洗脫,使印跡聚合物形成更多的特異性結(jié)合位點,使得dex-MMIPs的吸附量高于MPS-MMIPs。以上結(jié)果說明制備的dex-MMIPs傳質(zhì)效率和吸附量有很大的提高,更能滿足日益發(fā)展的社會對于物質(zhì)前處理的要求。

圖6 對酪胺的動態(tài)吸附實驗Fig.6 Dynamic binding experiments for TM

對四種聚合物的動力學(xué)曲線進(jìn)行偽二級動力學(xué)分析[15],得出的結(jié)果如表1所示。其中R2均大于0.99說明偽二級動力學(xué)方程線性擬合較好,理論值得到的Qe分別為3.09、1.83、2.56和1.86 mg·g-1,與實驗值3.05、1.72、2.08和1.41 mg·g-1(圖6)符合,證明符合偽二級動力學(xué)方程。

表1 聚合物偽二級動力學(xué)模型參數(shù)Table 1 Parameters of pseudo-second-order model of polymers

2.5 不同磁性載體的印跡聚合物靜態(tài)吸附實驗

聚合物對酪胺的吸附量都隨著濃度的增加而增加,當(dāng)濃度達(dá)到20 mg·L-1時吸附速度減慢,這是由于聚合物對酪胺的吸附接近飽和。dex-MMIPs對TM的吸附量總是高于MPS-MMIPs(圖7),這可能是因為葡聚糖表面的眾多基團(tuán),使得在磁性粒子表面形成的印跡聚合物層很薄,同時傳質(zhì)速率的提高,使得模板分子洗脫的更徹底,表面的特異性孔穴增多,相比于MPS-MMIPs解決了包埋過深,洗脫不完全導(dǎo)致的吸附量不高的問題。兩種非印跡聚合物的吸附量則相差不大,因為不存在模板分子的問題,都是非特異性的吸附位點,故而沒有明顯區(qū)別。

圖7 對酪胺的靜態(tài)吸附Fig.7 Static binding isotherms for TM

圖8是對聚合物進(jìn)行Scatchard分析,印跡聚合物通過Q/C對Q作圖可以明顯看出呈現(xiàn)非線性關(guān)系,存在兩種吸附曲線,表明存在兩種不同的結(jié)合位點[16]。通過擬合可以得出dex-MMIPs和MPS-MMIPs的髙親和力位點方程分別為y=-0.159x+1.1794和y=-0.092x+0.5974,計算得到Qm分別為7.4和6.4 mg·g-1證明dex-MMIPs比MPS-MMIPs吸附性能方面呈現(xiàn)一定的優(yōu)勢。

圖8 聚合物的Scatchard分析Fig.8 Scatchard analysis of polymers

2.6 特異性吸附實驗

從圖9可以看出,dex-MNIPs和MPS-MNIPs對兩種物質(zhì)的吸附量都不高,并且差異不顯著,說明非印跡聚合物對物質(zhì)的吸附只是非特異性吸附,在合成過程中沒有模板分子的存在,并沒有形成特異性的孔穴，但是dex-MNIPs相比MPS-MNIPs的分離效果要更好,是因為模板分子洗脫更完全,留下了更多的特異性位點,在本實驗中對煙酰胺和酪胺的分離效果不是特別好,推測原因是兩種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)類似,同樣存在可能產(chǎn)生氫鍵的O和N的影響。

圖9 聚合物對酪胺(TM)和煙酰胺(VPP)的選擇性Fig.9 Selectivity of polymers for Tyramine(TM)and Nicotinamide(VPP)

3 結(jié)論

以酪胺為模板分子,將表面分子印跡和磁性納米技術(shù)相結(jié)合,以羧甲基葡聚糖包被的磁性納米粒子為新型載體,成功制備酪胺的dex-MMIPs,通過與硅烷偶聯(lián)劑修飾磁性納米粒子為載體制備的MPS-MMIPs進(jìn)行比較,dex-MMIPs在20 min左右達(dá)到吸附平衡,而MPS-MMIPs則至少需要60 min,表明葡聚糖修飾磁性微球具有優(yōu)于硅烷偶聯(lián)劑修飾磁性微球的傳質(zhì)性能。本文為酪胺預(yù)處理提供了一種新的傳質(zhì)效率高,穩(wěn)定性好的表面分子印跡方法,為后期在食品中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)性研究。