朱立賢,鄭 婷,董鵬程,張一敏,毛衍偉,梁榮蓉,馬文健,羅 欣,*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東泰安 271018; 2.威海海洋職業(yè)學(xué)院,山東威海 264300; 3.陽信縣畜牧獸醫(yī)局,山東陽信 251800)

沙門氏菌作為一種重要食源性致病菌,其引發(fā)疾病的特征性臨床癥狀主要有急性胃腸炎、敗血癥和傷寒、副傷寒等[1]。由于沙門氏菌對人類的危害嚴重且分布廣泛,因此世界各國常通過檢測沙門氏菌是否存在,作為食品衛(wèi)生與否的一個重要的指標[2]。美國每年有140萬人通過食物源感染沙門氏菌[3]。在中國,40%～60%的食源性疾病是由沙門氏菌引起的[4]。在各類食品中,動物性食品如牛肉、豬肉、蛋、乳類等是引起沙門氏菌病暴發(fā)的主要媒介[5-6]。我國牛肉中沙門氏菌的檢出率為3%～6%[7-9]。

沙門氏菌是主要的食源性致病菌之一,極易通過糞便、皮毛及交叉污染散播到肉牛屠宰和加工環(huán)境中,進而對分割牛肉造成一定的污染。采取有效的殺菌方法對預(yù)防沙門氏菌病具有重要作用。食品的殺菌方法有很多種,如熱殺菌、非熱殺菌(超高壓、微波、輻射、高壓脈沖電場殺菌)、添加各種防腐劑或抑菌劑等,而實現(xiàn)非熱殺菌在實際生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用還有一段距離,對食品工業(yè)和消費者來說熱處理殺菌仍是最有效、最簡便、使用最廣泛的殺菌方法[10-11]。在很多情況下,細菌的熱失活曲線并不遵循對數(shù)線性關(guān)系,在擬合細菌熱失活曲線時經(jīng)常出現(xiàn)非線性的現(xiàn)象[12]。近年來,Weibull模型被廣泛的應(yīng)用于食品微生物失活模型的擬合[13-14]。Chun等[15]研究了輻照對即食火腿中沙門氏菌失活模型的影響,Weibull模型很好地擬合了失活曲線。Chen[16]對牛奶中沙門氏菌的壓力失活模型進行了評價,Weibull方程和Logistic方程的擬合性好于線性方程。韓洪玲等[17]研究表明,Weibull 模型可用來擬合金黃色葡萄球菌對超高壓失活的抗性曲線,擬合效果優(yōu)于Gompertz模型和線性模型。

國內(nèi)有關(guān)致病菌預(yù)測模型的研究大多采用的是單一血清型菌種的人工污染[17-18],不同血清型沙門氏菌的耐熱性不同[19]。美國農(nóng)業(yè)部食品安全檢驗局建議使用不同血清型的混合菌株進行模擬接種試驗,國外在建立沙門氏菌預(yù)測模型時大多是通過接種不同血清型的混合菌株進行研究[20-21]。因此，本研究選取了4個不同血清型沙門氏菌的混合菌株(3株分離自牛肉,1株ATCC菌株)進行熱失活研究,以便更好地模擬沙門氏菌的實際污染情況。本文研究了不同溫度熱處理對牛肉中沙門氏菌的影響,用Weibull模型擬合牛肉中沙門氏菌的非線性失活曲線,建立了牛肉中沙門氏菌的熱失活模型,為牛肉中沙門氏菌的控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

TSB(胰蛋白胨大豆肉湯) 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;Hektoen Enteric Agar HE培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;Bag Filter-400 拍打袋 法國 Interscience公司;4株不同血清型的沙門氏菌混合菌株分別是腸炎沙門氏菌(Salmonella.Enteritidis)、德爾卑沙門氏菌(Salmonella.Derby)、阿貢納沙門氏菌(Salmonella.Agona)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella.TyphimuriumATCC 14028),前三株均為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物性食品研究室董鵬程博士保存的牛肉源沙門氏菌菌株;牛肉樣品是從山東某肉牛屠宰公司取的背最長肌,放入帶冰的泡沫箱中3 h內(nèi)運回實驗室備用。

Bag Mixer-400W均質(zhì)器 法國Interscience公司;Healsafe1200生物安全柜 法國力申科學(xué)儀器有限公司;CS504高級恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司;Gilson P200移液器 濟南莊盟生物技術(shù)有限公司;HP-9272恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DZ-300/2S小型程控全自動真空封裝機 金橋科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的準備 無菌操作取背最長肌,在紫外燈下照射30 min后去除外周,無菌條件下將其切成1 mm厚的薄片,以每份(5.00±0.05) g進行真空密封,然后保存于-20 ℃?zhèn)溆?使用前置于0～4 ℃無菌條件下解凍,解凍后至實驗之前,樣品一直置于0～4 ℃條件下。

1.2.2 菌懸液的制備 無菌條件下,將4株不同血清型的沙門氏菌分別平板劃線后挑取單菌落,分別接入TSB液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h,得到生長至穩(wěn)定期的菌懸液(經(jīng)預(yù)實驗反復(fù)試驗后的結(jié)果,4種菌株一樣的培養(yǎng)條件),4株菌制得的菌懸液濃度約為108CFU/mL,將其1∶1∶1∶1混合,得到混合菌株菌懸液。

1.2.3 接種及真空密封 參考馮曉慧等[22]的方法,無菌操作取樣品(5.00±0.05) g于菌懸液中浸蘸15 min(不斷攪拌),于無菌鐵網(wǎng)上晾2 h,然后裝于拍打袋中,用0.1 MPa的真空度抽真空,使密封的樣本充滿整個袋子并使其厚度小于1 mm,以確保傳熱的統(tǒng)一。同時,按同樣的操作將未經(jīng)接種沙門氏菌菌液的肉樣浸蘸于無菌蛋白胨水中作為空白對照。

1.2.4 熱處理 將接種后的樣品分別置于55、57.5、60、62.5和65 ℃溫度條件的恒溫循環(huán)水浴鍋中進行熱處理[23]。加熱時間從1.5～35 min不等(加熱時間的確定是綜合考慮預(yù)實驗試驗結(jié)果和加熱溫度而定),熱處理溫度、時間與取樣頻率見表1。加熱時,將樣品快速地浸入熱水中,按設(shè)計的時間間隔定時取出部分樣品進行測定。將熱處理后的樣品取出立即放入冰水中阻止失活過程的繼續(xù)。每一組溫度時間的組合重復(fù)3次。

表1 熱處理的溫度、時間及時間間隔Table 1 Temperature,time and time intervals of thermal treatments

1.2.5 沙門氏菌計數(shù) 參考Yadav等[24]的方法,略有改動,取出冷卻過的經(jīng)熱處理的肉樣,表面用75%乙醇消毒,無菌條件下剪開,加入45 mL的0.1%無菌蛋白胨水,用均質(zhì)器以最大速度(8次擠壓/秒)拍打2 min,然后進行梯度稀釋,取3個適宜濃度的稀釋液涂布在HE選擇性培養(yǎng)基上。涂布完成后,先將平板置于室溫下約2 h,以使熱受傷的細胞復(fù)蘇,然后于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計數(shù),算出平均值并轉(zhuǎn)換成lg(CFU/g)。

1.2.6 模型的建立和驗證

1.2.6.1 沙門氏菌一級熱失活模型的建立 分別將牛肉中沙門氏菌在55、57.5、60、62.5和65 ℃熱處理條件下得到的試驗數(shù)據(jù)進行擬合,用Weibull模型描述不同溫度條件下的殘存菌量與時間的關(guān)系。Weibull模型是將失活曲線看作細菌失活致死積累分布形式,這種累積形式可以用以下公式[25]來表示:

lg(Nt/N0)=-btn

式(1)

式中,N0為熱處理前樣品中沙門氏菌菌落數(shù)(CFU/g),Nt為熱處理后樣品中沙門氏菌菌落數(shù)(CFU/g),b為模型的規(guī)模參數(shù)(scale parameter),n為曲線形狀參數(shù)(shape parameter)。

1.2.6.2 熱處理溫度對失活模型參數(shù)影響的二級模型的建立 利用線性回歸的方法對沙門氏菌熱失活參數(shù)b的自然對數(shù)值與溫度(55～65 ℃)(式(2))進行擬合,得到牛肉中沙門氏菌失活的二級模型。

lnb=aT-c

式(2)

式中b是Weibull模型中的參數(shù),a、c是常量系數(shù),T是溫度。

1.2.6.3 沙門氏菌的熱失活模型的驗證 本研究采用的是外部驗證[26],在55～65 ℃間隨機選58.5 ℃和65 ℃的熱失活數(shù)據(jù)對模型進行驗證。應(yīng)用建立的沙門氏菌熱失活動力學(xué)模型求得58.5 ℃和64 ℃下的預(yù)測值,與在58.5 ℃和64 ℃熱處理實驗中的沙門氏菌的實際檢測值進行比較,采用準確度Af、偏差度Bf、和均方根誤差(RMSE)來評價所建模型的可靠性[27],準確因子、偏差因子和均方根誤差的表達式如下:

Af=10(∑|Npre-Nobs|)/n

Bf=10(∑(Npre-Nobs))/n

式中,Nobs是實際測得的沙門氏菌數(shù)量的對數(shù)值,Npre是應(yīng)用沙門氏菌熱失活模型得到的與Nobs同一時間的微生物數(shù)量的對數(shù)值,n是試驗次數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.0 統(tǒng)計軟件對選取的Weibull模型進行擬合建立一級模型,通過線性回歸建立溫度對一級模型參數(shù)影響的二級模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同熱處理條件下沙門氏菌的一級熱失活模型的建立

目前,建立致病微生物預(yù)測模型的培養(yǎng)基質(zhì)一般分為兩種,一是基于液體培養(yǎng)基,此方法簡單、快速,比在真實食品上更容易控制不同的影響因子[28]。大部分已建立的模型都是在液體培養(yǎng)基上建立的,例如美國農(nóng)業(yè)部開發(fā)的致病菌預(yù)測程序(PMP),英國的農(nóng)、漁、食品部(UKMAFF)與英國食品研究所(IFR)聯(lián)合開發(fā)的食品微模型都是基于此[29],但缺點是沒有考慮到原料組織(脂肪含量,pH和水分活度)對微生物的實際影響,因此預(yù)測結(jié)果往往偏高[30-31]。二是以真實食品(肉類、果蔬制品、蛋類和乳類等)為基質(zhì)來獲得微生物的生長或失活數(shù)據(jù)從而建立預(yù)測模型,雖然方法繁瑣,測定數(shù)值的精度低于液體培養(yǎng)基,但能充分考慮食品原料組織對微生物的實際影響作用,真實性高,所建動力學(xué)模型能有效預(yù)測微生物在實際食品上的情況[32]。因此,本研究將沙門氏菌接種到牛肉表面建立沙門氏菌的熱失活模型。

采用Weibull模型擬合牛肉中沙門氏菌的熱失活曲線見圖1,相關(guān)參數(shù)見表2。Weibull模型擬合的熱失活曲線的p值均小于0.01,判定系數(shù)R2分別為0.993(55 ℃)、0.984(57.5 ℃)、0.999(60 ℃)、0.999(62.5 ℃)和0.998(65 ℃),即在0.984～0.999之間,說明Weibull模型能很好地擬合牛肉中沙門氏菌的熱失活曲線。參數(shù)b是模型的尺度參數(shù),反映對細菌致死效果的優(yōu)劣,b值越大,說明細菌活菌的瞬時降低速度越快,抵抗不利環(huán)境的能力就越差,b受熱處理溫度的影響[33]。在微生物的失活/致死動力學(xué)的研究中,常因細菌含有亞菌群,導(dǎo)致存活曲線呈非線性,當(dāng)用微生物殘存菌量或菌數(shù)減少量-時間曲線來表達不同致死因子殺滅微生物的作用效果時,一般會出現(xiàn)S形、凸形、凹形等曲線形式[33]。參數(shù)n是形狀參數(shù),一方面直觀反映失活曲線的形狀,另一方面n值的大小代表特定意義。n>1,曲線呈凸面,表明失活模型的曲線隨時間的增加呈加快的趨勢,即時間越長,微生物越易死亡,熱處理對細菌有累計殺滅作用[34];n值越接近于1,說明Weibull曲線越接近線形。當(dāng)n<1時,模型呈現(xiàn)凹狀的存活曲線,n越小,存活曲線的下降趨勢減慢,說明菌株的殘存菌量較高[35]。一般同一種處理對同種微生物的影響相似,n值變化不顯著,為了模型的簡化,可將n值視為定值[33,36],本實驗中n值平均值為0.59,曲線呈凹形,說明隨著加熱時間延長對沙門氏菌產(chǎn)生了拖尾效應(yīng),這與Mattick等[37]報道的培養(yǎng)基中沙門氏菌的熱失活曲線和Phungamngoen等[38]研究的沙門氏菌耐熱性的結(jié)果一致。類似的研究Li等[39]用Weibull模型擬合了花生醬中沙門氏菌熱失活曲線也呈下凹現(xiàn)象。

圖1 Weibull模型在55、57.5、60、62.5和65 ℃條件下擬合牛肉中沙門氏菌的熱失活曲線Fig.1 Thermal inactivation curve of Salmonella in beef under 55,57.5,60,62.5 and 65 ℃ applying Weibull model

表2 沙門氏菌熱失活模型的參數(shù)Table 2 Parameter values of the thermal inactivation model for Salmonella in beef

2.2 沙門氏菌二級失活模型的建立

由以上分析可知,應(yīng)用Weibull最適失活模型均能擬合不同溫度下沙門氏菌的熱致死情況,但卻無法描述不同加熱溫度的變化對沙門氏菌熱失活的影響,因此需要建立一個關(guān)于溫度對一級模型參數(shù)b影響的二級模型。由圖2可以看出,Weibull模型一級模型參數(shù)b受溫度的影響,隨著加熱溫度的升高,參數(shù)b不斷呈指數(shù)增大,其擬合方程為lnb=0.47T-28.07,相關(guān)系數(shù)R2為0.909,說明該模型描述的溫度與一級模型參數(shù)b之間的關(guān)系是可信的。

圖2 溫度對Weibull模型參數(shù)b的影響Fig.2 Effect of temperature on the parameter b of the Weibull model

2.3 熱失活動力學(xué)模型的驗證

為了全面評價所建模型的可靠性,Ross[27]提出了準確度和偏差度的概念,準確度Af衡量預(yù)測值和實驗值之間的差異,偏差度Bf表示預(yù)測值上下波動的幅度。本試驗用在58.5和64 ℃條件下沙門氏菌存活的觀察值與應(yīng)用預(yù)測模型計算得到的沙門氏菌存活的預(yù)測值來計算準確度Af偏差度Bf和RMSE,以綜合評價和驗證模型的可靠性。

由表3可以看出,Af為1.071和1.056,說明預(yù)測值和實測值之間的差異是在10%以內(nèi);Bf為0.998和1.002,說明預(yù)測值上下波動的幅度小于10%;RMSE值均小于0.12,誤差較小,進一步說明本研究建立的模型能很好地預(yù)測不同溫度處理對沙門氏菌的影響。

表3 58.5 ℃和64 ℃熱處理牛肉中沙門氏菌失活預(yù)測值的 準確度(Af),偏差度(Bf)和RMSETable 3 Accuracy factor,bias factor and RMSE of Salmonella in beef at 58.5 and 64 ℃

3 結(jié)論

該文應(yīng)用Weibull模型擬合了不同熱處理條件下牛肉中沙門氏菌的失活曲線,相關(guān)系數(shù)(R2)在0.984～0.999之間,說明Weibull模型能很好地擬合牛肉中沙門氏菌的熱失活情況;建立了溫度對Weibull模型參數(shù)b影響的二級模型,即lnb=0.47T-28.07,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.909。用58.5和64 ℃下實際的沙門氏菌存活數(shù)對所建的模型進行驗證,準確度(Af)和偏差度(Bf)均在可接受范圍內(nèi),表明該模型能很好地預(yù)測牛肉中沙門氏菌在58.5和64 ℃下的失活動態(tài)。本文得到的牛肉中沙門氏菌失活模型可以快速可靠的預(yù)測沙門氏菌在55～65 ℃之間的熱失活情況,可以作為熱處理殺滅牛肉中沙門氏菌的理論參考。