曾璇竹,雷于國,胡國元,*,郭 嘉

(1.武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北武漢 430205； 2.湖北裕國菇業(yè)股份有限公司,湖北隨州 441300； 3.綠色化工過程教育部重點實驗室,湖北武漢 430205)

硒(Selenium,Se)是人體必需的一種微量礦質(zhì)元素,對維持機(jī)體的抗氧化活性及抵抗能力至關(guān)重要,具有防癌抗癌、延緩衰老等生理功能[1-2]。香菇(Lentinulaedodes)具有一定的富硒能力,由香菇富集的有機(jī)硒具有較好的穩(wěn)定性,不僅方便貯存、運輸,還能夠更好地與食品中的其它成分配合,避免其中某些營養(yǎng)成分的流失,從而更容易被人體吸收利用[3]。富集硒后的香菇多糖是一種有機(jī)硒化合物,其生物藥理活性普遍高于多糖和硒,還能提供其它的有益營養(yǎng)元素和活性物質(zhì)[4]。

本實驗采取液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的方式,通過加入Na2SeO3溶液,研究培養(yǎng)基pH、硒滅菌方式、硒添加時間、硒添加量和發(fā)酵時間對富硒香菇多糖的影響,初步確定富硒香菇胞內(nèi)及胞外多糖的最優(yōu)發(fā)酵條件,并了解硒添加對香菇多糖DPPH自由基清除活性的影響,為富硒香菇發(fā)酵研究及深加工提供一定的參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

秋栽7號 香菇菌種,湖北裕國菇業(yè)股份有限公司;玉米粉(食品級) 市售;葡萄糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、亞甲藍(lán)、亞硒酸鈉 均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;酵母粉 安琪酵母股份有限公司;蛋白胨、酵母浸膏、瓊脂 北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;七水硫酸鎂、無水硫酸鎂 分析純,西隴化工股份有限公司;2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH) 上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司;完全培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖20、酵母浸膏2、蛋白胨2、磷酸二氫鉀0.46、磷酸氫二鉀1、七水硫酸鎂0.05、瓊脂20、pH自然;液體種子培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖10、酵母粉20、玉米粉過0.15孔徑篩(100目)15、磷酸二氫鉀3、無水硫酸鎂1.5;發(fā)酵培養(yǎng)基 同液體種子培養(yǎng)基。

GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精密試驗設(shè)備有限公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;CJ-2D潔凈工作臺 天津杰斯特設(shè)備有限公司;DK-S24電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;MQT-60恒溫?fù)u床 上海旻泉儀器有限公司;PHS-3C酸度計 上海理達(dá)儀器廠;SHZ-A循環(huán)式真空泵 鞏義予華儀器有限公司;BL-220H型電子天平 日本SHIMADZU公司;GZX-9030MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;TG16-WS型離心機(jī) 長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化和馴化 將秋栽7號菌塊接入新鮮的完全培養(yǎng)基平板上活化,25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后,將活化好的菌種接種到硒濃度為1 mg/L的完全培養(yǎng)基平板上進(jìn)行馴化,25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d,讓菌種適應(yīng)低濃度的硒[7-9]。

1.2.2 液體種子的制備 在250 mL三角瓶中,加入100 mL 的液體種子培養(yǎng)基和1 g/L的Na2SeO3溶液,使硒在液體培養(yǎng)基中的濃度為1 mg/L,每瓶打孔接種4個馴化好的菌餅(直徑約為0.672 cm)[10],靜置24 h以后,25 ℃搖床培養(yǎng)7 d,轉(zhuǎn)速為150 r/min。

1.2.3 硒源滅菌方式的確定 配置以下三種硒源滅菌方式不同的發(fā)酵培養(yǎng)基,裝液量為100 mL/250 mL。方式一:將亞硒酸鈉溶液添加至培養(yǎng)基后再一起高壓滅菌;方式二:亞硒酸鈉溶液與培養(yǎng)基分別高壓滅菌后再添加;方式三:亞硒酸鈉溶液過濾除菌后再添加至已高壓滅菌的培養(yǎng)基中;在無菌條件下將培養(yǎng)了7 d的液體種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量為10%,25 ℃、150 r/min下?lián)u床培養(yǎng)10 d,測定生物量及胞內(nèi)多糖提取量。

1.2.4 硒源添加濃度的確定 采用過濾除菌的方式對硒源進(jìn)行滅菌,配制發(fā)酵培養(yǎng)基使硒的濃度分別達(dá)到0、4、6、8、10、12和14 mg/L,無菌條件下接入液體種子,接種量為10%,25 ℃、150 r/min下?lián)u床培養(yǎng)10 d,測定生物量及胞內(nèi)多糖提取量[11]。

1.2.5 硒源添加時間的確定 采用過濾除菌的方式對硒源進(jìn)行滅菌,分別在發(fā)酵的第0、2、4、6、7和8 d加入8 mg/L亞硒酸鈉溶液[12],無菌條件下接入液體種子,接種量為10%,25 ℃、150 r/min下?lián)u床培養(yǎng)10 d,測定生物量及胞內(nèi)多糖提取量。

1.2.6 初始pH的確定 采用過濾除菌方式對硒源進(jìn)行滅菌,將培養(yǎng)基的pH調(diào)至為3、4、5、自然(5.67)、6、7,無菌條件下接入液體種子,接種量為10%,第7 d時加入8 mg/L的亞硒酸鈉溶液,25 ℃、150 r/min下?lián)u床培養(yǎng)10 d,測定生物量及胞內(nèi)多糖提取量。

1.2.7 發(fā)酵時間的確定 采用過濾除菌方式對硒源進(jìn)行滅菌,將培養(yǎng)基的pH調(diào)至4,無菌條件下接入液體種子,接種量為10%,第7 d時加入8 mg/L的亞硒酸鈉溶液,分別在發(fā)酵的第9、10、11、12和13 d結(jié)束發(fā)酵,25 ℃、150 r/min下?lián)u床培養(yǎng),測定生物量及胞內(nèi)多糖提取量[13]。

1.2.8 Box-Behnken試驗設(shè)計 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,固定硒源滅菌方式為過濾除菌,發(fā)酵時間為11 d,采用Box-Behnken試驗設(shè)計方法,以硒源添加濃度、硒源添加時間和培養(yǎng)基pH為相應(yīng)變量,分別以X1、X2和X3表示,并以-1、0、1分別代表變量的水平,以富硒香菇多糖提取量為響應(yīng)值,通過響應(yīng)曲面分析進(jìn)行制備條件的優(yōu)化,從而得到最優(yōu)發(fā)酵條件[14]。

表1 Box-Behnken設(shè)計試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.9 生物量的測定 發(fā)酵培養(yǎng)得到的香菇菌絲體與發(fā)酵液分離后,用蒸餾水反復(fù)沖洗,直至水洗液經(jīng)亞甲藍(lán)鑒定后[15],無硒為止,60～80 ℃烘干至恒重,稱重即為香菇菌絲體生物量,并磨粉備用。

1.2.10 香菇多糖的提取量測定 稱取一定量1.2.9中獲得的菌絲體粉末,加入蒸餾水搖勻,料液比為1∶20(g/mL),靜止30 min,置于90 ℃恒溫水浴鍋浸提2 h。用布氏漏斗抽濾,獲得濾液。將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀均濃縮,濃縮比為1∶20(g/mL)。濃縮后加入無水乙醇至終濃度為60%,醇沉15 h后,4000 r/min下離心15 min,去上清液,烘干至恒重后稱重,即為香菇胞內(nèi)多糖提取量。發(fā)酵液抽濾除去菌絲體,濃縮發(fā)酵液至原體積1/4,加入無水乙醇,乙醇濃度為75%,醇沉15 h后,4000 r/min離心15 min,去上清液,烘干至恒重后稱重,即為香菇胞外多糖提取量[16-18]。

1.2.11 香菇多糖的純化及抗氧化活性的測定 經(jīng)優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件下獲得富硒香菇胞內(nèi)及胞外多糖,脫蛋白[19-20]后,同1.2.10的方法醇沉烘干并磨粉。并按一定梯度(200～1000 μg/mL)溶解粉末后待測,以相同條件下未加硒源發(fā)酵培養(yǎng)得到的香菇胞內(nèi)及胞外多糖及VC做對比[21-22],實驗分為樣品組、對照組和空白組,加入樣品和0.2 mmol/L DPPH自由基溶液后,用渦旋振蕩器充分混勻,避光反應(yīng)30 min,517 nm處測定吸光值。

DPPH清除率(%)=[1-(A樣品-A對照)/A空白]×100

式中，A樣品為樣品(2 mL)+DPPH溶液(2 mL)的吸光度;A對照為樣品(2 mL)+無水乙醇(2 mL)的吸光度;A空白為DPPH溶液(2 mL)+無水乙醇(2 mL)的吸光度[23-25]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

上述實驗均設(shè)置3組平行,用Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差的統(tǒng)計分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。響應(yīng)面實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析采用Design-Expert V8.0.6.1軟件,采用Tukey-Kramer post-hoc test對實驗結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒源滅菌方式對富硒香菇液體發(fā)酵的影響

如圖1可知,方式一的生物量最高為1.2149 g/100 mL,三種方式下所得到的生物量較相近。方式三的胞內(nèi)多糖提取量最高為32.4 mg/100 mL,方式三的胞內(nèi)多糖提取量明顯高于方式一。三種硒源滅菌方式下得到的菌絲體形態(tài)有明顯差異,方式一得到的菌絲球呈粉紅色,這是由于生物的紅硒化現(xiàn)象,細(xì)胞將毒性較大的亞硒酸鈉還原成無毒的硒元素,紅色硒元素是一種人體不能吸收利用的硒形態(tài)[26],所以在實踐生產(chǎn)中應(yīng)盡可能減少紅硒現(xiàn)象發(fā)生,為此選用相對安全且胞內(nèi)多糖提取量高的方式三(過濾除菌方式)對硒源進(jìn)行滅菌。

圖1 硒源滅菌方式對富硒香菇發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of sterilization conditions of Se on Se-enriched L. edodes

2.2 培養(yǎng)基硒濃度對富硒香菇發(fā)酵的影響

由圖2可知,隨著硒濃度的增高,胞內(nèi)多糖的提取量波動比較明顯,加硒濃度為6 mg/L時,菌絲體中胞內(nèi)多糖提取量達(dá)到峰值,為33.8 mg/100 mL。加硒濃度為8 mg/L時,菌絲體生物量最高達(dá)1.1032 g/100 mL。由圖2可知,加硒濃度在6～8 mg/L時,其生物量和胞內(nèi)多糖提取量均高于未加硒時的值,說明加硒不僅能促進(jìn)生物量的增加,也能促進(jìn)胞內(nèi)多糖的生成。通過比較,初步確定培養(yǎng)基中加入8 mg/L的Na2SeO3溶液為富硒香菇發(fā)酵的最佳硒添加量。

圖2 硒濃度對富硒香菇發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of Se concentration on Se-enriched L. edodes

2.3 加硒時間對富硒香菇液體發(fā)酵的影響

由圖3可得,生物量的值相對比較穩(wěn)定,第7 d時達(dá)到1.0812 g/100 mL。從菌絲中提取的胞內(nèi)多糖提取量來看,第7 d前添加,胞內(nèi)多糖提取量走勢比較平緩,在第7 d添加時,提取出的胞內(nèi)多糖提取量最高為57.6 mg/100 mL,且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組。在第8 d添加時,胞內(nèi)多糖提取量下降至26.9 mg/100 mL,說明在菌絲體生長過程中添加亞硒酸鈉溶液,對富硒香菇多糖的影響較大,第7 d添加為富硒香菇發(fā)酵中硒源的最佳補添時間,可促進(jìn)菌絲體內(nèi)胞內(nèi)多糖的積累。

圖3 硒添加時間對富硒香菇發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of Se replenishing time on Se-enriched L. edodes

2.4 培養(yǎng)基pH對富硒香菇發(fā)酵的影響

培養(yǎng)基自然pH為5.67±0.012。由圖4可知,在pH=4時,生物量達(dá)到最大值1.4848 g/100 mL,相對于空白組(pH=5.67)高出1.5倍,胞內(nèi)多糖提取量也達(dá)到最高值39.8 mg/100 mL。由此可見,培養(yǎng)基pH對富硒香菇發(fā)酵的影響較大,富硒香菇能更好地適應(yīng)酸性環(huán)境。當(dāng)pH大于4且逐漸升高時,生物量及胞內(nèi)多糖的提取量均呈下降趨勢,pH=7時,不管是生物量還是胞內(nèi)多糖提取量均受到非常明顯的抑制作用,幾乎是停止了生長。因此可將培養(yǎng)基pH調(diào)至4,此時的生物量及胞內(nèi)多糖的提取量都達(dá)到最大。

圖4 培養(yǎng)基pH對富硒香菇發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of medium pH on Se-enriched L. edodes

2.5 發(fā)酵時間對富硒香菇液體發(fā)酵的影響

由圖5可得,富硒香菇發(fā)酵從第9～11 d的生物量一直處于迅速增長的趨勢,到第11 d時,生物量達(dá)到峰值,為1.0037 g/100 mL,第11～13 d中,生物量增長平緩。胞內(nèi)多糖提取量也在發(fā)酵第11 d時達(dá)到最大值,為29 mg/100 mL,第11 d后,胞內(nèi)多糖提取量開始降低,降低幅度相對較快。因此確定富硒香菇發(fā)酵的最佳時間為11 d。

圖5 發(fā)酵時間對富硒香菇發(fā)酵的影響Fig.5 Effects of fermentation time on Se-enriched L. edodes

2.6 響應(yīng)曲面法優(yōu)化富硒香菇發(fā)酵工藝

根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計原理,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,以香菇胞內(nèi)及胞外多糖提取量為響應(yīng)值,響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析實驗方案與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results for response surface analysis

表3 富硒香菇胞內(nèi)多糖的響應(yīng)面分析試驗方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the developed regression model of intracellular polysaccharide of Se-enriched L. edodes

圖6 各兩因素交互作用對富硒 香菇胞內(nèi)多糖影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots showing the interactive effects of various fermentation conditions on the intracellular polysaccharide of Se-enriched L. edodes

表4 富硒香菇胞外多糖的響應(yīng)面分析試驗方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance for the developed regression model of extracellular polysaccharide of Se-enriched L. edodes

圖7 各兩因素交互作用對富硒香菇 胞外多糖影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plots showing the interactive effects of various fermentation conditions on the extracellular polysaccharide of Se-enriched L. edodes

相比之下,B圖響應(yīng)面曲線的坡度最大,說明X1加硒濃度和X3培養(yǎng)基pH兩者的交互作用對胞外多糖提取量有明顯影響。X2加硒濃度在6～7 mg/L,X3培養(yǎng)基pH在4～4.5的范圍內(nèi)存在極值,說明兩者之間存在較好的交互作用。通過對胞外多糖的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,得出的最佳發(fā)酵條件為:采用過濾除菌方式對硒源滅菌,培養(yǎng)基pH調(diào)至4.01,發(fā)酵至第7.98 d(191.5 h),向發(fā)酵液中添加6.68 mg/L Na2SeO3,發(fā)酵11 d,此時胞外多糖提取量預(yù)測響應(yīng)值為895.68 mg/100 mL。為檢驗RSM的可靠性,進(jìn)行驗證實驗,得實際值853.96 mg/100 mL。驗證值與理論值間的相對誤差為4.65%。富硒香菇胞內(nèi)及胞外多糖提取量在一定范圍內(nèi)隨加硒濃度、加硒時間和培養(yǎng)基pH的增加而提高,當(dāng)其水平越過一定值后,富硒香菇胞內(nèi)及胞外多糖提取量隨之將降低[28]。

2.7 香菇多糖DPPH自由基清除能力比較

將四種脫蛋白后的香菇多糖進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋,其DPPH自由基清除率如圖8所示。隨著溶液濃度的上升,DPPH自由基清除率也上升,可見香菇多糖對DPPH自由基有一定清除效果,四種香菇多糖對清除率的作用影響由大到小的順序為富硒香菇胞內(nèi)多糖>香菇胞內(nèi)多糖>富硒香菇胞外多糖>香菇胞外多糖,實驗結(jié)果表明,香菇胞內(nèi)多糖的清除能力明顯優(yōu)于香菇胞外多糖的清除能力,硒的添加能提高了香菇胞內(nèi)及胞外多糖對DPPH自由基的清除效率。富集硒的過程不僅提高了香菇多糖提取量,同時也提高了其抗DPPH的清除能力[29-30]。

圖8 香菇多糖的DPPH自由基清除能力Fig.8 DPPH scavenging rate with diferent concentrations of L. edodes polysaccharide

3 結(jié)論

為優(yōu)化富硒香菇多糖的發(fā)酵條件,進(jìn)行了單因素和響應(yīng)面的實驗分析,得出最佳發(fā)酵條件,當(dāng)培養(yǎng)基pH調(diào)至4.16,發(fā)酵至第162 h時向發(fā)酵液中添加7.97 mg/L過濾除菌的Na2SeO3溶液,發(fā)酵11 d,富硒香菇胞內(nèi)多糖提取量可達(dá)到71.54 mg/100 mL;當(dāng)培養(yǎng)基pH調(diào)至4.01,發(fā)酵至第191.5 h時向培養(yǎng)基中添加6.68 mg/L過濾除菌的Na2SeO3溶液,發(fā)酵11 d,富硒香菇胞外多糖提取量可達(dá)到853.96 mg/100 mL。結(jié)果顯示,富硒可以促進(jìn)菌絲合成,有助于菌絲的生長及多糖的累積。香菇多糖對DPPH自由基有一定清除效果,香菇胞內(nèi)多糖的清除能力明顯優(yōu)于香菇胞外多糖的清除能力,硒的添加能提高了香菇胞內(nèi)及胞外多糖對DPPH自由基的清除效率富集硒的過程不僅提高香菇多糖提取量,同時也提高了其抗氧化活性作用。本試驗在香菇液體發(fā)酵生成多糖的過程中,加入無機(jī)硒,使硒元素與香菇多糖有機(jī)結(jié)合,并優(yōu)化其發(fā)酵條件,得到的富硒香菇多糖既能夠保持多糖的基本構(gòu)型和生物活性,又避免了無機(jī)硒對人體的毒性和副作用,富硒香菇多糖作為一種安全、有效、健康的硒營養(yǎng)源,開發(fā)前景十分可觀。