黃 謙,朱明揚,羅林根,石 浩,吳少平

(1.岳陽市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心,湖南岳陽 414000; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),湖南長沙 410000)

茶葉是世界三大飲料之一,我國茶資源豐富,飲茶歷史悠久。飲茶帶來的人體健康效應(yīng)受到國內(nèi)外眾多研究人員的關(guān)注[1-2]。茶葉多糖是茶葉中的一種重要功能性成分,多糖具有抗氧化、抗衰老[3],增強免疫力[4]、防止動脈粥樣硬化[5],降低血糖血壓[6]等功效;同時茶葉多糖具有吸收快、代謝徹底、無殘留等優(yōu)點,幾乎無毒副作用。目前國內(nèi)外對茶葉多糖多采用熱水直接浸提法,該方法操作簡單、方便,但浸提效率以及得率都較低,不適應(yīng)如今工業(yè)上大規(guī)?？焖?、高效的生產(chǎn)[7]。本文采用酶-水超聲浸提法對茶葉多糖進行提取實驗,此法相對于一般水提法,同樣具有操作簡單、對操作環(huán)境要求低、具有較高的實用性、安全環(huán)保等特點,同時還具有高產(chǎn)出和高效性[8]。由于茶葉中粗纖維含量高,對多糖的快速提取造成了一定的難度,通過酶液的添加可提前破壞細(xì)胞壁外圍纖維,同時通過超聲波助提加快提取速率[9]。本文首次運用主成分分析與正交試驗相結(jié)合,對茶葉多糖提取工藝進行相關(guān)研究,實驗選取影響茶葉多糖提取得率的10個提取因素進行主成分分析,以獲得影響茶葉多糖提取得率的主成分,再結(jié)合正交試驗設(shè)計篩選最佳的提取條件組合,對茶葉多糖提取工藝條件進行綜合研究,為茶葉制品工業(yè)化利用和茶葉多糖的制備提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

毛尖茶(當(dāng)年采摘綠茶) 購于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)和潤茶業(yè)科技有限公司,粉粹后過篩得茶葉粉末;木瓜蛋白酶(≥60萬U/g) Sigma公司;有機溶劑石油醚、正丁醇、氯仿、無水乙醇、苯酚、8%濃硫酸、無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品等 分析純，上海國藥生產(chǎn)。

THZ-92B可調(diào)速控溫?fù)u床 上海浦東物理儀器廠;DR-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;202-1電熱恒溫干燥箱 長沙康隆儀器設(shè)備有限公司;ZW1105051705紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;TG16臺式高速離心機 長沙英泰儀器有限責(zé)任公司;KQ2200DB超聲波儀 上海五相儀器儀表有限公司;DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶葉多糖的制備 茶葉在陰暗處、20～25 ℃、30%～70%相對濕度條件下的可控倉庫中貯藏。取已貯藏1個月茶葉打粉、過30目篩,精確稱取1.0 g茶葉粉末,蒸餾水作為提取溶劑,料液比為1∶15(g/mL),用最終濃度為1%木瓜蛋白酶反應(yīng)1 h后，于50 ℃下分別超聲(300 W)提取1次,提取時間0.5 h[10]。提取后抽濾,合并濾液,濾液濃縮至10 mL,最終濃度為50%乙醇沉淀,10 mL蒸餾水溶解,采用Sevag試劑清除蛋白。

1.2.2 茶葉多糖提取得率的測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.2508 g,置于250 mL容量瓶中,加蒸餾水溶解并稀釋至刻度,配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后分別量取2.5、5.0、10、15、20 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液置于100 mL容量瓶中稀釋至刻度,配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取1 mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞試管中,再分別移取1 mL新配制的5%苯酚溶液和5 mL 98%的濃硫酸,用玻璃棒攪拌混勻,常溫下放置20 min,沸水浴3 min,自來水冷沖洗試管冷卻后，用蒸餾水補至10 mL,取1 mL測定吸光值A(chǔ)490 nm,以同體積蒸餾水為陰性對照。得回歸方程:y=0.0092x+0.0076(R2=0.9996)。對上述制備的茶葉多糖稀釋至一定體積后，用硫酸-苯酚法測定其含量及提取得率。

茶葉多糖提取得率(%)=Ci×n/m

式中:Ci:測定濃度(μg/mL),n:稀釋倍數(shù)(10000),m:茶葉質(zhì)量(10 g)。

1.2.3 多糖超聲提取單因素實驗 通過相關(guān)文獻(xiàn)的查閱與了解[11],本文選取10個影響多糖提取得率的常見因素進行超聲波提取實驗。準(zhǔn)確稱取相同質(zhì)量的茶葉粉末,改變其中的某一個單因素條件,其它固定因素水平同1.2.1,進行超聲提取、測定多糖提取得率,考察每一個單因素對茶葉多糖提取得率的影響。

提取次數(shù)分別為1、2、3、4、5次。終濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%木瓜蛋白酶反應(yīng)1 h后提取,確定提取得率。酶反應(yīng)時間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3 h。提取溫度分別50、60、70、85、100 ℃。最終濃度分別為50%、65%、75%、80%、90%無水乙醇沉淀,確定提取得率。料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL)的條件下,確定提取得率。提取時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h的條件下,確定提取得率。超聲功率分別為300、500、700、1000、1500 W的條件下,確定提取得率。茶葉粉碎度分別在40、50、60、70、80目的條件下,確定提取得率。茶葉貯藏期分別為1、3、6、12、18個月確定提取得率。

1.2.4 正交試驗設(shè)計 篩選主要因素指標(biāo)和實驗水平,通過單因素主成分分析結(jié)果得到四因素三水平正交試驗設(shè)計列表1,以茶葉多糖的提取得率作為依據(jù),確定最佳工藝條件。

表1 正交試驗設(shè)計Table 1 Orthogonal experimental design

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 單因素實驗結(jié)果運用SPSS 19.0軟件進行主成分分析。數(shù)據(jù)采用Origin制圖,ASS 9.0統(tǒng)計軟件進行顯著性分析,α=0.05為顯著性水平,p<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 超聲功率的影響 茶葉多糖提取得率隨著超聲功率的升高出現(xiàn)升高的趨勢,但超聲功率超過1000 W時有所降低。如圖1所示,在超聲功率為300 W時，茶葉多糖提取得率僅為2.8%左右,當(dāng)功率增加到1000 W時，茶葉多糖提取得率達(dá)到最大值,說明超聲提取能極大地提高對天然植物功效成分的提取得率,且在前4個水平間多糖得率均具有顯著性差異(p<0.05)。但當(dāng)超聲功率達(dá)到1500 W時茶葉多糖提取得率有所下降,很可能是過高的功率破壞了茶葉多糖的結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致得率下降[12]。因此,由于減少能量消耗及茶葉多糖提取得率方面的考慮,選擇700～1000 W超聲功率較為適宜。

圖1 超聲功率對多糖提取得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on polysaccharide extraction 注:圖中不同字母表明差異性顯著(p<0.05),下同。

2.1.2 料液比的影響 茶葉多糖提取得率隨著料液比的升高有緩慢增加的趨勢。如圖2所示,采用1∶10提取時,得率較低,僅為2.8%。當(dāng)料液比在1∶20～1∶30時,茶葉多糖提取得率迅速增加,當(dāng)料液比為1∶40時,茶葉多糖提取得率幾乎達(dá)到了最大值,相對于1∶10增加了42.5%,且在前4個水平間多糖得率均具有顯著性差異(p<0.05)。提取液作為一種溶劑,溶劑量的增加可加大溶質(zhì)的溶出量,但隨著多糖溶出量的耗盡以至于多糖得率趨于平穩(wěn)[13]。因此,選擇料液比為1∶40 g/mL之間較為合適。

圖2 料液比對提取得率的影響Fig.2 Effect of ratio of feed to liquid on extraction yield of polysaccharide

2.1.3 提取次數(shù)的影響 茶葉多糖提取得率隨著提取次數(shù)的增加而增加。如圖3所示,提取1次時,提取得率較低,僅為2.8%。當(dāng)提取次數(shù)增加到2次時,相對于提取1次茶葉多糖的提取得率有較大幅度的增加，呈現(xiàn)顯著差異(p<0.05),這可能是提取次數(shù)過少導(dǎo)致提取不完全,適當(dāng)增加提取次數(shù)有利于茶葉多糖的完全溶解;但后期增加趨勢緩慢,這和周楊[14]等的研究結(jié)果較為相似。因此,考慮到效率,選擇超聲提取2～3次較為適宜。

圖3 提取次數(shù)對提取得率的影響Fig.3 Effect of extraction times on extraction yield of polysaccharide

2.1.4 提取時間的影響 茶葉多糖提取得率隨著提取時間的增加而逐漸增加。如圖4所示,當(dāng)提取時間為0.5 h時,茶葉多糖提取得率較低。提取時間超過0.5 h后,多糖得率有較大程度的提高(提取時間在0.5～1.5 h之間時,各水平間p<0.05),提取時間的延長在很大程度上有利于提取得率的提高[15]。2.0 h的時提取時間可使多糖幾乎完全溶出,達(dá)到了4.0%左右,因此,選擇1.5～2.0 h較為適宜。

圖4 提取時間對提取得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction yield of polysaccharide

2.1.5 提取溫度的影響 茶葉多糖提取得率隨著溫度的升高有逐漸增加的趨勢。如圖5所示,采用提取溫度為50 ℃時,得率較低,僅為2.8%。在提取溫度為60～85 ℃時,茶葉多糖提取得率急劇升高(各水平間p<0.05),相對于50 ℃的茶葉多糖提取得率增加了53.2%,這是由于隨著溫度的升高加大了茶葉多糖水中的溶解度;當(dāng)溫度超過85 ℃時,茶葉多糖提取得率的增加量逐漸放緩,這是因為高溫會破壞茶葉多糖的結(jié)構(gòu)[16],因此,85 ℃較合適。

圖5 提取溫度對提取得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction yield of polysaccharide

2.1.6 粉碎度的影響 茶葉多糖提取得率隨著粉碎度的增加有增加的趨勢,但后期略微有所減低。如圖6所示,茶葉粉末過30～50目時,所得粉末越細(xì),多糖提取得率越高。茶葉過50目篩時,對茶葉多糖提取得率達(dá)到最大值,相對于過30目篩的茶葉,茶葉多糖提取得率增加了10%以上。隨后多糖提取利率有緩慢降低的趨勢,且不具有顯著性差異(50～70目水平間p>0.05),可能是因為過小的顆粒導(dǎo)致其它成分的大量浸出從而阻礙多糖的提取[17],因此,選取50目顆粒大小的茶葉進行多糖的提取較為適宜。

圖6 粉碎度對提取得率的影響Fig.6 Effect of powder degree on extraction yield of polysaccharide

2.1.7 乙醇濃度的影響 由于不同乙醇濃度的極性大小不同,茶葉多糖在不同乙醇濃度中的溶解度也不同[18],在50%～75%乙醇濃度范圍內(nèi),茶葉多糖提取得率隨乙醇濃度增加而增加,乙醇濃度大于75%時，則茶葉多糖提取得率逐漸減少,如圖7所示,5種乙醇濃度中以75%濃度乙醇對茶葉多糖的沉淀效果最好,達(dá)到3.63%,相對于50%乙醇濃度,多糖的率具有極顯著性差異(p<0.01),茶葉多糖提取得率增加了20%以上。

圖7 乙醇濃度對提取得率的影響Fig.7 Effect of ethanol concentration on extraction yield of polysaccharide

2.1.8 貯藏期的影響 如圖8所示,茶葉多糖提取得率隨著茶葉貯藏期的延長,在第六個月時茶葉多糖提取得率達(dá)到最大值,之后茶葉多糖提取得率有下降趨勢(p>0.05)。其原因可能是因為自身的呼吸消耗和微生物的消耗導(dǎo)致茶葉多糖減少[19]。因此,選擇貯藏3～12個月的茶葉進行多糖的浸提效果較好。

圖8 貯藏期對提取得率的影響Fig.8 Effect of storage time on extraction yield of polysaccharide

2.1.9 酶濃度的影響 茶葉多糖提取得率隨著酶液濃度的增加有增加的趨勢。如圖9所示,低酶量時提取得率低,但隨著酶量的增加,加大了與底物的結(jié)合面積,茶葉多糖提取得率明顯提高,當(dāng)酶量由1%增加到3%時,茶葉多糖提取得率有較大程度的提高(各水平間p<0.05),相對于1%酶量增加了34.6%,但由于酶量的飽和,后期隨酶濃度的增加,茶葉多糖提取得率增加量趨于平穩(wěn)[20]?？紤]到實際生產(chǎn)的科學(xué)性,因此,選擇4%左右的酶濃度較為合理。

2.1.10 酶反應(yīng)時間的影響 茶葉多糖提取得率隨著酶反應(yīng)時間的增加有增加的趨勢。如圖10所示,在2.5 h酶反應(yīng)時間內(nèi)，隨著時間的增加茶葉多糖提取得率有較大程度的升高,在這段時間內(nèi),底物與酶反應(yīng)較為激烈,反應(yīng)強度大;當(dāng)酶反應(yīng)時間達(dá)到2.5 h時,茶葉多糖提取得率有最大值,相對于酶反應(yīng)1.0 h增加了46.7%;隨酶反應(yīng)時間的延長,反應(yīng)較為徹底,茶葉多糖提取得率增加量趨于平穩(wěn)[21]。考慮到生產(chǎn)效率等因素,超聲提取2.5 h與2.0 h多糖得率具有顯著性差異(p<0.05)。因此,選取2.5 h的酶反應(yīng)時間較為合理。

圖10 酶反應(yīng)時間對提取得率的影響Fig.10 Effect of enzyme reaction time on extraction yield of polysaccharide

2.2 茶葉多糖提取單因素結(jié)果主成分分析

主成分分析有助于對多個單因素的綜合考量,確定各因素在某一實驗結(jié)果中所占據(jù)比例的大小,常用于各行業(yè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析之中[22]。此次用于影響植物成分(茶葉多糖)提取得率方面的研究,以探討各因素的關(guān)系與比重[23]。

2.2.1 主成分指標(biāo) 選取在各單因素條件下茶葉多糖提取得率結(jié)果見表2。

2.2.2 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理 利用SPSS 19.0進行多糖提取得率數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化分析,得標(biāo)準(zhǔn)化值,如表3所示。

表3 標(biāo)準(zhǔn)化值結(jié)果Table 3 The result of standard value

2.2.3 主要成分個數(shù)確定 通過SPSS軟件共抽取了4個主成分,從表4可以看出,第一成分占據(jù)了88.947%的比重,第二個成分占據(jù)了10.270%的比重,其余占據(jù)的比重很小,已低于1%。

表4 特征值Table 4 The component matrix

從表5可以看出,第一主成分中,影響多糖提取得率相關(guān)性大小前四的單因素分別為:超聲溫度、提取次數(shù)、酶反應(yīng)時間、超聲功率,相關(guān)性越大對多糖提取得率的影響就越大。這4個單因素主要反映在實驗處理的強度,實驗強度越大,茶葉多糖提取得率越高。在第二主成分中溶劑濃度、粉碎度、貯藏期等相關(guān)性比較大。由于第一成分占據(jù)的比重最大,因此它對茶葉多糖提取得率的影響也就最大,其成分中各因素數(shù)字越大，對茶葉多糖提取得率的影響也就也大;因此選取上述第一主成分中主要因素進行正交試驗。

表5 載荷矩陣Table 5 The load matrix

2.2.4 綜合模型構(gòu)建 采用SPSS軟件對成分矩陣中相關(guān)數(shù)值進行數(shù)據(jù)規(guī)格化特征向量分析,得數(shù)據(jù)于表6。由于前兩個主成分所占據(jù)比重很大,因此可由它們代替原有的10個單因素,構(gòu)建成分與原來指標(biāo)之間的表達(dá)式為:

表6 規(guī)格化特征向量Table 6 The standardized eigenvector

f1=0.333X1+0.197X2+0.328X3+0.331X4+0.33X5+0.316X6+0.32X7+0.325X8+0.33X9+0.329X10

f2=-0.063X1+0.797X2-0.19X3-0.084X4-0.142X5-0.352X6+0.278X7-0.237X8-0.171X9+0.172X10

F=0.292X1+0.259X2+0.274X3+0.288X4+0.281X5+0.249X6+0.315X7+0.266X8+0.278X9+0.313X10

其中,A1和γ分別為成特征向量對應(yīng)相關(guān)系數(shù)和特征值,X1～X10為標(biāo)準(zhǔn)化值,F為綜合評價指標(biāo),計算得5個出綜合評價值F,如表7所示。

由表7可知,成分f1呈現(xiàn)由升-降的趨勢,這與綜合評價值F大致相同。由于f1所占比重較大,在某種程度上已可以替代所有10個單因素。同時從主成分f1可以看出，影響茶葉多糖提取得率的因素隨著各試驗水平強度的加強,多糖提取得率也逐漸增加,當(dāng)實驗強度處于第4水平時,提取得率最高。成分f2在第3水平時多糖提取得率最高,由載荷矩陣可知,溶劑濃度的正相關(guān)值較高,達(dá)到了0.808,其次是貯藏期為0.278,這與茶葉多糖提取得率值的實際情況相符合。通過f1和f2得到綜合評價值F,在第3～5試驗水平的條件下，茶葉多糖的提取得率均有可能得到最大值,因此選擇這3個水平的實驗強度用于后續(xù)正交試驗的分析。

表7 綜合評價變量及F值Table 7 The variables of comprehensive evaluation and Fvalue

2.3 正交試驗結(jié)果與驗證

2.3.1 正交試驗 選取表1中的試驗條件及因素水平,同時其它各單因素選取較優(yōu)條件。其正交試驗結(jié)果見表8。正交試驗最佳組合為A2B2C2D3,即85 ℃提取溫度、1000 W超聲功率、提取4次、酶反應(yīng)3 h。考慮到茶葉多糖工業(yè)化生產(chǎn)的可行性和便捷操作性,選擇提取次數(shù)3次較宜。

表8 正交試驗結(jié)果Table 8 The results of orthogonal experiment

2.3.2 驗證實驗 采用上述所得工藝條件,結(jié)合其余六個較優(yōu)單因素實驗條件(6個月貯藏期、50目茶葉粉末、1∶40 g/mL料液比、4.0%酶濃度、2 h超聲時間、75%乙醇沉淀)進行5次平行驗證,最終得到茶葉多糖的平均提取得率為(5.01%±0.08%)。

3 結(jié)論

本文在10個單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,通過主成分分析得出超聲溫度、超聲時間、酶反應(yīng)時間、料液比相對于其它單因素對茶葉多糖提取得率有較大的相關(guān)性,這說明各單因素對茶葉多糖提取得率的影響具有一定的差異性。同時得到茶葉多糖提取得率綜合評價變量及F值,以此判定得出3、4、5階段的實驗強度對茶葉多糖的提取具有較大的影響,從而在很大程度上明確了各單因素不同實驗強度對茶葉多糖提取得率的影響。主成分分析法相對單因素和正交試驗來說,一方面了解各單因素對茶葉多糖提取得率的影響,另一方面避免了正交試驗中對單因素選擇的不科學(xué)性,得到影響茶葉多糖提取得率的最佳提取工藝A2B2C2D3,即酶反應(yīng)3.0 h后于85 ℃下、1000 W超聲提取,提取4次。對工藝的驗證,此時多糖得率為(5.01%±0.08%)。利用酶-水超聲提取技術(shù)、主成分分析和正交試驗相結(jié)合很好地兼顧了茶葉多糖提取的時間和較高的得率,試驗結(jié)論在一定程度上為后期茶葉多糖大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了依據(jù)。本實驗通過10個單因素實驗初步了解影響茶葉多糖提取得率的因素,但還可進一步深入研究。