段雙梅,鄭吉文,李永席,李正華,石興云,王利妍,郭天杰,呂才有,趙 明,馬 燕,*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤普洱茶學(xué)院,云南昆明 650201; 2.云南省德宏州茶葉技術(shù)推廣站,云南德宏 678400)

茶樹[Camelliasinensis(L.)O. Kuntze]是山茶科(Theaceae)、山茶屬(Camellia)多年生常綠木本植物[1]。云南是世界茶樹起源的中心,保存了豐富的茶樹種質(zhì)資源,為茶學(xué)遺傳多樣性研究提供寶貴的研究材料[2]。鳳慶位于滇西南,在北回歸線附近,具有立體氣候特征,被譽(yù)為世界滇紅之鄉(xiāng),中國紅茶之都[3]。鳳慶擁有豐富的茶樹種質(zhì)資源,是目前全國范圍內(nèi)古茶樹最多的地方之一[4],也是世界茶樹發(fā)源地中心地帶之一[5]。全縣古茶樹資源面積56000多畝,包括栽培型、“半野生”型、野生型古茶樹,有多達(dá)31600多畝野生古茶樹群落,約有126600棵野生古茶樹[5]。鳳慶當(dāng)?shù)亓挤N也比較多,包括鳳慶大葉群體種,野生苞紅茶、勐庫大葉種[5]、香歸銀毫、清水3號、鳳慶7號、鳳慶9號、探春銀毫、早春翠芽、華豐28號等[6]。

“大山茶”是近年來鳳慶地區(qū)新近發(fā)展起來的一個地方栽培材料,主要分布于鳳慶的詩禮(成片分布)、小灣、大寺、洛黨鎮(zhèn)、三岔河、鳳山鎮(zhèn)等地。其葉質(zhì)柔軟、嫩葉油亮及頂芽均無茶毫。現(xiàn)主要用于加工紅茶,當(dāng)?shù)胤Q為“野生紅”,干茶外形烏潤,香氣獨(dú)特,湯色金黃油亮;滋味濃醇鮮甜,深受廣大消費(fèi)者的喜愛。野生大山茶的樹型大小各異,分布散,由于生態(tài)環(huán)境優(yōu)越,物種多樣性豐富,食物鏈(網(wǎng))結(jié)構(gòu)復(fù)雜,不易發(fā)生病蟲害[7]。在野生“大山茶”的基礎(chǔ)上,許多茶農(nóng)通過幼苗扦插、嫁接等技術(shù),正在擴(kuò)大“大山茶”的種植面積。前期楊崇仁、張穎君等研究認(rèn)為“大山茶”是由大理茶引種[8],經(jīng)長期的雜交變異,形成了外觀形態(tài)及內(nèi)在品質(zhì)都存在顯著差異的多種茶樹類型[8]。段志芬等人利用常規(guī)方法測定86份云南野生茶樹樣品,并進(jìn)行聚類分析,其中大山茶聚在第三類,主要特征為水浸出物和茶多酚的含量較高[9]。但目前未見對“大山茶”的種質(zhì)資源進(jìn)行評價的研究報道。

本文對“大山茶”常規(guī)生化成分含量進(jìn)行了測定,應(yīng)用HPLC-MS/MS研究其化合物組成,為系統(tǒng)評價其種質(zhì)資源和開發(fā)利用提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶樣 本實(shí)驗(yàn)材料均采自云南鳳慶,分別為“大山茶”、云抗-10#、香歸銀毫、鳳慶九號、鳳慶大葉種,鮮葉采摘標(biāo)準(zhǔn)為一芽二葉,殺青，揉捻,日曬至足干;甲醇、乙腈 色譜純,美國TEDIA試劑公司;乙醇、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、醋酸乙酯、正丁醇、乙醇、碳酸氫鈉、草酸、三氯化鋁、磷酸鹽、茚三酮、蒽酮、茚三酮、福林酚試劑、焦性沒食子酸 均為國產(chǎn)分析純試劑;標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸(GA)、兒茶素(C)、咖啡堿(CA)、表沒食子酸兒茶素(EGC)、表兒茶素(EC)、1,4,6-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖(G-G)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG) 均購自天津一方科技有限公司。

高效液相色譜儀1200型 美國Agilent公司:包括UV檢測器 安捷倫1200VWD G1314B;柱溫箱 安捷倫1100/1200 G1316A;自動進(jìn)樣器 安捷倫1100-1200 溫控自動進(jìn)樣器 G1329A;在線脫氣機(jī) 安捷倫1100/1200 G1322A;溶劑輸送泵 安捷倫1100/1200四元泵G1311A和TSKgel ODS-80TM色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm) 日本TOSOH;串聯(lián)質(zhì)譜儀(MS/MS)為Q Exactive high-resolution mass spectrometer(Thermo,USA),Hypersil GOLD C18(100 mm×2.1 mm,1.9 μm);756CRT紫外可見分光光度計;101A-2型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱 上海市崇明實(shí)驗(yàn)儀器廠;DZKW-S-8電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;電子分析天平 奧豪斯儀器有限公司;HH-S28S數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市大地自動化儀器廠;CS-2000高速多功能粉碎機(jī) 武義海納電器有限公司;Smart-Q30實(shí)驗(yàn)室蒸餾水機(jī) 上海和泰儀器有限公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 常規(guī)化學(xué)成分測定 應(yīng)用差數(shù)法[10]、茚三酮比色法[11]、酒石酸鐵比色法[12]和硫酸蒽酮法[13],測定茶葉水浸出物、游離氨基酸、茶多酚和茶多糖含量。

1.2.2 兒茶素、沒食子酸和咖啡堿含量的測定

1.2.2.1 樣品溶液的制備 稱取1.0 g茶葉,研細(xì),加入2%磷酸10 mL,再加入10 mL甲醇,混合靜置1 h,過濾,濾液置于50 mL容量瓶,重復(fù)提取兩次,定容。

1.2.2.2 對照品溶液的制備 稱取GA、EC、EGC、EGCG、C、CA、GG和ECG標(biāo)品0.01 g,至于50 mL燒杯中,加入8 mL色譜級甲醇,溶解,定容至10 mL。

1.2.2.3 測定方法 應(yīng)用高速液相色譜系統(tǒng),測定兒茶素類、咖啡堿。流動相A為0.261%磷酸,5%乙腈;流動相B為0.261%磷酸,80%乙腈;洗脫梯度程序:0～21 min B液從10%線性梯度增加至20%;21～22 min,B液從20%線性梯度增加至100%;22～26 min,B液100%保持不變;26～26.5 min,B液由100%線性梯度降低至10% B;27 min程序停止;以10% B液后運(yùn)行平衡5 min;流速為1.0 mL/min;柱溫為40 ℃,進(jìn)樣量2 μL。

分別配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1和2 μg/μL的各種標(biāo)品溶液,每個濃度進(jìn)樣2次分析,以含量為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0.01～2 μg/μL之間,各標(biāo)品的含量與峰面積呈線性關(guān)系,R2均大于0.99(表1)。

表1 各標(biāo)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 1 The formula of various standard curves

1.2.3 大山茶茶葉化學(xué)物質(zhì)組成測定 茶樣按1.2.2.1方法提取,應(yīng)用LC-MS/MS分析大山茶樣品提取物的化學(xué)物質(zhì)組成。

1.2.3.1 超高效液相色譜條件 流動相A為0.05%甲酸水;流動相B為乙腈;柱溫:40 ℃,進(jìn)樣量:5 μL,流速:0.3 mL/min;梯度洗脫程序:0～2 min,B液從5%保持不變;2～9 min,B液從5%線性梯度增加至50%;9～11 min,B液50%保持不變;11～15 min,B液由50%線性梯度降低至95%;15～18 min,B液由95%保持不變;18～18.1 min,B液由95%降低至5%;18.1～20 min,B液由5%保持不變;21 min程序停止。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 串聯(lián)質(zhì)譜儀(MS/MS)為Q Exactive high-resolution mass spectrometer(Thermo,USA),噴霧電壓:+3500 V/-3000 V;霧化溫度:350 ℃;鞘氣壓力:35 arb;輔助氣壓力:10 arb;離子傳輸管溫度:320 ℃;S-Lens RF:50 V;掃描模式:Fullscan-ddms2;掃描范圍:m/z 135～2000;分辨率:70000(Fullscan)/17500(ms2)。

1.2.3.3 化合物鑒定 對樣品質(zhì)譜檢測正負(fù)模式總離子流圖中色譜峰進(jìn)行提取,獲得樣品化合物一級、二級精確質(zhì)量數(shù)和保留時間信息。根據(jù)一級、二級質(zhì)譜圖中產(chǎn)生的精確質(zhì)量數(shù)信息,對譜圖中產(chǎn)生的一級母離子和二級碎片進(jìn)行元素組成的擬合;采用Mass Frontier軟件對質(zhì)譜信息進(jìn)行解析,利用特征碎片進(jìn)行結(jié)構(gòu)歸屬從而完成化合物一級結(jié)構(gòu)的合理推測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品平行制備2份供試品溶液,每個溶液測定2次,以mean±SD表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,組間采用最小顯著差數(shù)法進(jìn)行兩兩比較,p<0.05為差異顯著。統(tǒng)計分析與數(shù)據(jù)處理應(yīng)用軟件IBM spss statistics 22(SPSS Inc.,Chicago,IL)進(jìn)行?；衔镏饕肗CBI(https://www.ncbi. nlm.nih.gov/)和Scripps Center for Metabolomics(https://metlin.scripps.edu/index.php)進(jìn)行鑒定和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 茶樣生化成分測定

各樣品水浸出物、游離氨基酸、茶多糖、茶多酚含量見表2,應(yīng)用HPLC測定茶樣兒茶素、咖啡堿含量,部分測定色譜圖見圖1。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)“大山茶”水浸出物含量為48.77%，與其它樣品無顯著差異(p>0.05),水浸出物含量決定了茶湯的湯色和滋味[14],測定結(jié)果表明“大山茶”具有云南大葉種茶樹水浸出物高的特點(diǎn),為其湯色和滋味品質(zhì)特征提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。茶多酚是茶湯的主要呈味物質(zhì),也是茶葉的主要功效物質(zhì),具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗病毒等生物活性[15]。“大山茶”的茶多酚含量為36.01%,顯著高于香歸銀毫和鳳慶大葉種(p<0.05),與鳳慶九號和云抗-10#樣品無顯著差異(p>0.05)。測定發(fā)現(xiàn)“大山茶”的游離氨基酸含量為1.66%,與已有報道相當(dāng),其酚氨比為21.6∶1,也表明其適制紅茶。茶多糖具有降血糖、抗凝血、抗血栓、降血脂等保護(hù)心血管的作用,同時可抗輻射、抗氧化等增強(qiáng)機(jī)體免疫力[16]。表2結(jié)果顯示“大山茶”茶多糖含量顯著高于其他樣品(p<0.05)?？Х葔A是一種黃嘌呤生物堿化合物[17],具有抗疲勞、興奮神經(jīng)、抗癌等作用,是茶葉重要的風(fēng)味物質(zhì)及生理活性特征成分[18],但是攝入過多的咖啡易造成高血壓、心律不齊、流產(chǎn)等不良現(xiàn)象[19-20]。本研究中“大山茶”咖啡堿含量顯著低于鳳慶大葉種、鳳慶九號和云抗-10#樣品(p<0.05),與香歸銀毫無顯著差異(p>0.05)。綜合來看,“大山茶”具有茶多酚含量高、咖啡堿含量相對較低的特征。

表2 茶樣生化成分含量Table 2 Contents of biochemical components in various teas

圖1 茶葉兒茶素、咖啡堿測定色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of catechins and caffeine in tea extraction

2.2 “大山茶”提取物的LC-MS/MS分析

應(yīng)用Thermo U3000 UHPLC超高效液相和Thermo QExactive高分辨質(zhì)譜儀聯(lián)用的方法,分別應(yīng)用正離子模式和負(fù)離子模式檢測鑒定“大山茶”提取物(圖2),進(jìn)行峰提取,獲取化合物保留時間,通過一級、二級精確質(zhì)譜信息確定化合物結(jié)構(gòu),從“大山茶”中共鑒定到了44種化合物(見表3)。利用NCBI的Compound數(shù)據(jù)庫,上述化合物分別為:酸類11個、黃酮及黃酮醇類15個、酚酸5個、兒茶素類6個、氨基酸類3個、嘌呤堿類2個和未知2個。與已有的報道相比較,朱旗等[21]利用LC-MS分析普洱茶、茯磚茶和紅茶化學(xué)成分,共鑒定22種化合物。本研究從大山茶中鑒定了44個化合物,增加了對茶樹化學(xué)物質(zhì)組成的認(rèn)識。

表3 從大山茶提取物檢測鑒定的化合物Table 3 Compounds identified in Dashancha

續(xù)表

圖2 正負(fù)離子模式下測定的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of Dsshancha by positive and negative ion mode注:a:正離子模式下測定的總離子流圖; b:負(fù)離子模式下測定的總離子流圖。

HPLC測定發(fā)現(xiàn),“大山茶”中3.669、7.590、12.579 min的峰面積明顯高于本實(shí)驗(yàn)中的同等質(zhì)量的其它品種提取物(圖1)。進(jìn)一步通過LC-MS的方法,測定該3個化合物,在負(fù)離子模式下,分子量為343.07、633.07和785.09。對比LC-MS/MS結(jié)果(表2),將3.669 min的化合物初步鑒定為3-Galloylquinic acid(3-沒食子?；鼘幩?,7.590 min的化合物初步鑒定為Corilagin(柯里拉京),12.579 min的化合物需要進(jìn)一步研究。Corilagin是水溶性鞣質(zhì),屬天然植物多酚單寧酸類化合物[22],具有抗氧化、抗動脈硬化、抗腫瘤、抗病毒等生物學(xué)活性[23],可開發(fā)加工為食品添加劑、藥物或保健品等。最早張玉玲從茶葉中鑒定到3-沒食子?；鼘幩?并認(rèn)為是綠茶中刺激性成分[24],而Stagg G V認(rèn)為在紅茶發(fā)酵過程中3-沒食子?；鼘幩峥赡軈⑴c色素的形成[25]。本文測定發(fā)現(xiàn)“大山茶”的Corilagin和3-Galloylquinic acid峰面積高于相同質(zhì)量的云抗10#提取物,其含量高低與“大山茶”生物活性以及加工紅茶品質(zhì)關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

應(yīng)用分光光度法和HPLC方法測定分析了“大山茶”在內(nèi)的5個鳳慶栽培品種或材料的兒茶素、咖啡堿、水浸出物、茶多酚、游離氨基酸、茶多糖等生化成分,其中“大山茶”茶多酚含量高,咖啡堿含量較低,酚氨比為21.6∶1,適制紅茶。應(yīng)用LC-MS/MS從大山茶中共鑒定出酸類、黃酮及黃酮醇類、酚酸、兒茶素等44個化合物。HPLC測定發(fā)現(xiàn)“大山茶”的3個峰的峰面積,高于同等質(zhì)量其它品種提取物的對應(yīng)峰面積,其中2個鑒定為柯里拉京與沒食子?；鼘幩帷＞C上,本文研究初步表明“大山茶”具有云南大葉種高水浸出物、高茶多酚的典型特征,并且部分化合物含量高于國家茶樹良種云抗-10#,有望選育為新的茶樹良種。