錢偉 馮星月 陳曉峰 王建平 蔣志濤 余輝

摘要：目的 建立超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/MS）測定護腎（Ⅲ）號膠囊給藥后大鼠血漿中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1含量的方法，并對其藥代動力學(xué)特征進行研究。方法 SD大鼠灌胃護腎（Ⅲ）號膠囊2 g/kg后按時間點取血，以地高辛為內(nèi)標(biāo)，采用UHPLC-MS/MS測定給藥不同時點血漿中三七皂苷R1和人參皂苷Rg1濃度，并用DAS2.0軟件計算藥代動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果 三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的線性關(guān)系良好（r≥0.997 5）；日內(nèi)、日間精密度RSD均小于13.1%，準確度、回收率及穩(wěn)定性符合生物樣品分析要求。大鼠體內(nèi)三七皂苷R1藥代動力學(xué)參數(shù)：T1/2（7.86±1.69）h，Tmax（4.00±1.04）h，Cmax（0.23±0.05）mg/L；人參皂苷Rg1藥代動力學(xué)參數(shù)：T1/2（4.58±0.95）h，Tmax（6.00±0.00）h，Cmax（0.32±0.03）mg/L。結(jié)論 本研究建立的UHPLC-MS/MS分析方法靈敏、準確可靠，適用于護腎（Ⅲ）號膠囊的藥代動力學(xué)研究。

關(guān)鍵詞：護腎（Ⅲ）號膠囊；超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；藥代動力學(xué)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.017

中圖分類號：R285.5 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）07-0071-04

Abstract： Objective To establish a UHPLC-MS/MS method for the determination of notoginsenoside R1 and ginsenoside Rg1 in rat plasma after oral administration of Hushen （Ⅲ） Capsules； To study its pharmacokinetics. Methods SD rats were given Hushen （Ⅲ） Capsules 2 g/kg and then the blood was collected at time point. Digoxin was used as internal standard. The drug concentrations of notoginsenoside R1 and ginsenoside Rg1 in plasma were determined by UHPLC-MS/MS. And the relative pharmacokinetic parameters were calculated by using DAS2.0 software. Results The linear relationship of notoginsenoside R1 and ginsenoside Rg1 was good （r≥0.997 5）. The RSD of intra-day and inter-day precision were less than 13.1%. The results of accuracy， recovery and stability met the requirements for the biology sample analysis. For notoginsenoside R1， the pharmacokinetics parameters T1/2， Tmax， Cmax in the plasma were （7.86±1.69）h， （4.00±1.04）h， （0.23±0.05）mg/L. For ginsenoside Rg1， the pharmacokinetics parameters T1/2， Tmax， Cmax in plasma were （4.58±0.95）h， （6.00±0.00）h， （0.32±0.03）mg/L. Conclusion The established UHPLC-MS/MS method is sensitive， accurate and reliable， and is suitable for the pharmacokinetic study of Hushen （Ⅲ） Capsules.

Keywords： Hushen （Ⅲ） Capsules； UHPLC-MS/MS； pharmacokinetics

目前，血尿形成機制尚未完全闡明，通常認為與免疫炎癥反應(yīng)導(dǎo)致腎小球基底膜受損有關(guān)，西醫(yī)治療往往效果不佳，遷延難愈。腎性血尿?qū)僦嗅t(yī)學(xué)“血證”范疇，中醫(yī)治療血尿積累了豐富的臨床經(jīng)驗，并取得了較好的療效[1]。護腎（Ⅲ）號膠囊是張家港市中醫(yī)醫(yī)院復(fù)方制劑，由白茅根、三七、大黃炭組成，具有清熱解毒、滋腎降火功效，臨床常用于治療血尿為主的各種腎病。三七作為方中臣藥，具有良好的止血、活血化瘀、消腫止痛作用，輔助君藥白茅根治療血尿諸癥。三七總皂苷為三七的主要有效成分，具有抗炎、增強免疫功能的作用。已有研究采用HPLC對護腎（Ⅲ）號膠囊的有效成分進行了含量測定[2]。本研究采用高效、靈敏的超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/MS）技術(shù)對護腎（Ⅲ）號膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1在血漿中的含量進行分析，并對其在大鼠血漿中的藥動學(xué)特征進行研究，為進一步開展護腎（Ⅲ）號膠囊臨床應(yīng)用研究，明確其作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 儀器、試藥與動物

Agilent 1290超高效液相色譜儀；Agilent 6430 LC-MS三重四級桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧化離子源（ESI），MassHunter色譜工作站；AE240電子天平（上海梅特勒-托利多有限公司）；MICRO-17R冷凍離心機（美國Thermo公司）；WH-2微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；Drict-Q5超純水機（法國Millipore公司）。

三七皂苷R1對照品（純度94%，批號110745- 201318）、人參皂苷Rg1對照品（純度95%，批號110703-201529）、地高辛對照品（純度99%，批號100015-201308），中國食品藥品檢定研究院；護腎（Ⅲ）號膠囊（批號170227），張家港市中醫(yī)醫(yī)院制劑室。

SPF級健康雄性SD大鼠8只，體質(zhì)量（240±20）g，南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供，合格證號SCXK（滬）2013-0006。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%，自然光照。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜檢測條件

色譜柱：Agilent ZOBAX SB C18柱（2.1 mm×150 mm，5 ?m）；流動相：甲醇-0.1%甲酸水溶液（75∶25）；流速：200 ?L/min；柱溫：35 ℃；進樣量：2 ?L。離子源：ESI；離子化模式：正離子；定量模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；毛細管電壓：4000 V；干燥氣溫度：400 ℃；Fragmentor及CE值：三七皂苷R1分別為300、40 V，人參皂苷Rg1分別為260、40 V，地高辛（內(nèi)標(biāo)）分別為270、50 V；檢測對象：三七皂苷R1 m/z 955.5→m/z 775.5；人參皂苷Rg1 m/z 823.5→m/z 643.5；內(nèi)標(biāo)m/z 803.6→m/z 283.1。各化合物質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.2 對照品溶液與內(nèi)標(biāo)溶液的配制

精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1對照品適量，用甲醇溶解于10 mL容量瓶中，制成三七皂苷R1、人參皂苷Rg1濃度分別為1.01、1.036 mg/mL的混合對照品貯備液。取上述貯備液，用甲醇稀釋，制成不同濃度的對照品溶液，用于考察線性關(guān)系。精密稱取地高辛對照品適量，加甲醇配制成濃度為2 ?g/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。對照品溶液與內(nèi)標(biāo)溶液均在4 ℃條件下貯藏。

2.3 給藥與樣品采集

SD大鼠8只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實驗前禁食12 h，自由飲水，按2 g/kg劑量灌胃給予護腎（Ⅲ）號膠囊（用0.5%CMC-Na溶解），分別于給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、2、4、6、8、12、24、48 h經(jīng)大鼠眼眶靜脈叢采血約0.2 mL，置于放有肝素鈉的離心管中，4000 r/min離心10 min，吸取血漿，放入-20 ℃冰箱冷凍保存。采用DAS2.0軟件對所測血藥濃度-時間數(shù)據(jù)進行處理。

2.4 血漿樣品的處理與分析

精密吸取血漿樣品50 ?L，置2 mL離心管中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液10 ?L，渦旋混勻30 s，加乙腈-甲醇（1∶1）混合溶劑500 ?L，沉淀蛋白，渦旋3 min，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，于37 ℃水浴中以氮氣流吹干，殘留物加甲醇-水（50∶50）溶劑100 ?L復(fù)溶，渦旋混勻3 min后，12 000 r/min離心10 min，取上清液2 ?L，進行UHPLC-MS/MS分析。按標(biāo)準曲線法，根據(jù)峰面積比值計算血漿樣品中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1的濃度。

2.5 方法學(xué)驗證

基質(zhì)特異性、靈敏度、線性、準確度、精密度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性均按2015年版《中華人民共和國藥典》關(guān)于“生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則”進行[3-4]。

2.5.1 專屬性考察

取大鼠空白血漿樣品、空白血漿加混合對照品及內(nèi)標(biāo)溶液、大鼠給藥后血漿樣品適量，按“2.4”項下方法進行處理分析，進樣測定，得到空白血漿、空白血漿+混合對照品、大鼠給藥后1 h血漿樣品中各待測成分的提取離子流圖，見圖1。結(jié)果顯示，護腎（Ⅲ）號膠囊中2種待測成分能與內(nèi)標(biāo)物完全分離，峰形良好，空白血漿在相應(yīng)時間處沒有出峰，無明顯雜質(zhì)和內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，表明該血漿處理方法及測定條件專屬性良好。

2.5.2 線性關(guān)系考察

在空白大鼠血漿中加入按“2.2”項下方法配制的系列對照品溶液，按“2.4”項下方法操作后進樣檢測，以待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，待測物濃度為橫坐標(biāo)，采用加權(quán)（1/x2）最小二乘法進行線性回歸分析，求得各成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍，根據(jù)信噪比（S/N）>10計算各成分的最低定量限，結(jié)果見表2。

2.5.3 精密度和準確度

取空白大鼠血漿，加入混合對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，配制成三七皂苷R1（2、4、96、384 ng/mL）和人參皂苷Rg1（1、2、48、192 ng/mL）最低定量限和低、中、高3個濃度的質(zhì)量控制（QC）樣品（n=6），按“2.4”項下方法進行操作，連續(xù)測定3 d。計算2種成分的日內(nèi)RSD均小于11.2%、日間RSD均小于13.1%，準確度均在93.8%～103.6%范圍內(nèi)，提示該方法準確、可靠、重現(xiàn)性好。

2.5.4 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)

取空白大鼠血漿100 ?L數(shù)份，按“2.4”項下方法分別制備低、中、高3個濃度三七皂苷R1、人參皂苷Rg1的QC樣品各6份，采用UHPLC-MS/MS方法分析，測得三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及內(nèi)標(biāo)的峰面積為A。另取空白大鼠血漿100 ?L數(shù)份，按“2.4”項下方法，蛋白沉淀離心后上清液中加入對應(yīng)濃度的混合對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，同法操作，得峰面積B。另取上述與QC樣品濃度相同的混合對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，按“2.4”項下“氮氣流吹干”后方法操作，得峰面積C。A與B的比值為提取回收率，B與C的比值為基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表3。提取回收率范圍為92.5%～101.4%，基質(zhì)效應(yīng)范圍為91.5%～106.2%，均符合要求。

2.5.5 藥代動力學(xué)研究

血漿樣品按“2.4”項下方法進行處理，按“2.1”項下條件進行測定，記錄峰面積并代入回歸方程，計算各時間點三七皂苷R1、人參皂苷Rg1的血藥濃度，繪制平均血藥濃度-時間曲線，見圖2。采用DAS2.0軟件計算藥代動力學(xué)參數(shù)并對藥物在大鼠體內(nèi)的動力學(xué)過程進行擬合，結(jié)果表明，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1在大鼠體內(nèi)代謝符合二室模型，其相關(guān)藥動學(xué)參數(shù)見表4。

大鼠灌胃護腎（Ⅲ）號膠囊后，藥代動力學(xué)研究結(jié)果表明，2種成分經(jīng)體內(nèi)吸收后達峰時間接近，三七皂苷R1在體內(nèi)吸收情況較人參皂苷Rg1為優(yōu)（AUC值較大）。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1在大鼠體內(nèi)的平均滯留時間（MRT0-48）均較長，分別為（5.12±1.26）h、（7.11±1.03）h，生物利用度高，可充分發(fā)揮藥效。

3 討論

本試驗比較了不同流動相洗脫體系，包括乙腈-水梯度洗脫[5-6]、乙腈-0.1%甲酸梯度洗脫[7]、乙腈- 20 mmol/L NaH2PO4（24∶76）[8]、甲醇-0.2 mol/L乙酸銨-冰醋酸（63∶37∶1）[9]及甲醇-0.1%甲酸水（75∶25），結(jié)果表明，所選流動相均能獲得較好的色譜峰形，考慮到流動相組成簡單、操作方便，并且試驗后色譜柱容易清洗，更好保護色譜柱，最終選擇甲醇- 0.1%甲酸水（75∶25）為流動相。

藥物進入動物體內(nèi)后，經(jīng)過吸收、分布、代謝，最后排出體外，在血漿樣品中除了含有原型待測藥物外，也含有待測藥物的代謝物、藥物與蛋白質(zhì)形成的結(jié)合物及內(nèi)源性物質(zhì)等，因此需要對血漿樣品進行前處理后測定血漿樣品中的待測藥物。本試驗考察了不同溶劑乙腈[10]、甲醇[11]、丙酮-甲醇（4∶1）[12]和乙腈-甲醇（1∶1）[13]沉淀血漿中蛋白的效果，結(jié)果表明，經(jīng)乙腈-甲醇（1∶1）處理的血漿樣品基質(zhì)效應(yīng)較小，靈敏度更高，峰形良好，因此選用此法處理血漿樣品。

本研究采用UHPLC-MS/MS對SD大鼠灌胃護腎（Ⅲ）號膠囊后三七皂苷R1、人參皂苷Rg1的藥代動力學(xué)進行研究，建立了準確、快速、靈敏的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1在大鼠體內(nèi)血藥濃度的測定方法，明確了皂苷成分體內(nèi)暴露程度及消除半衰期，進一步揭示了護腎（Ⅲ）號膠囊治療血尿諸證的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，有望較好地應(yīng)用于臨床，為后期的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制研究提供可靠的保障。

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（收稿日期：2017-09-28）

（修回日期：2017-12-03；編輯：陳靜）