宋韜 付洪義 李莉娟

[摘要] 目的 評(píng)價(jià)腦脊液T-SPOT.TB對(duì)結(jié)核性腦膜炎的診斷價(jià)值。 方法 選取2012年1月～2016年6月河北省胸科醫(yī)院結(jié)核內(nèi)科收治的疑診為結(jié)核性腦膜炎的147例患者，同時(shí)進(jìn)行腦脊液及外周血的T-SPOT.TB，依據(jù)患者的最終診斷，將遴選的133例分為結(jié)核性腦膜炎組和非結(jié)核性腦膜炎組，比較腦脊液及外周血的T-SPOT.TB的陽(yáng)性率與陰性率。 結(jié)果 所選患者中，結(jié)核性腦膜炎76例，非結(jié)核性腦膜炎57例。外周血T-SPOT.TB的敏感性為77.63%，與腦脊液的63.16%比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；腦脊液T-SPOT.TB的特異性為98.25%，高于外周血的84.21%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；腦脊液的T-SPOT.TB的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為97.96%，高于外周血的86.76%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；外周血的T-SPOT.TB的陰性預(yù)測(cè)值為73.85%，與腦脊液的66.67%比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。當(dāng)腦脊液的T-SPOT.TB的cut-off值在96 SFCs/106PEMC時(shí)，診斷結(jié)核性腦膜炎的敏感性為90.79%，特異性為98.25%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為98.57%，陰性預(yù)測(cè)值為88.89%，ROC曲線下面積為0.993（95%CI：0.982～1.000）。 結(jié)論 與外周血的T-SPOT.TB比較，腦脊液的T-SPOT.TB可大幅提高對(duì)結(jié)核性腦膜炎的特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，可顯著提高結(jié)核性腦膜炎的診斷水平。

[關(guān)鍵詞] T-SPOT.TB；結(jié)核性腦膜炎；腦脊液；外周血；敏感性；特異性

[中圖分類號(hào)] R529.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）06（a）-0050-05

[Abstract] Objective To evaluate the diagnostic value of T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid for tuberculous meningitis. Methods A total of 147 inpatients of suspected tuberculous meningitis in the Department of TB Medicine of Hebei Chest Hospital from January 2012 to June 2016 were selected. Based on final diagnosis， 133 patients were divided into two groups： tuberculous meningitis group and non tuberculous meningitis group. The positive and the negative rates of T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid and peripheral blood were compared. Results Among the patients， there were 76 cases of diagnosed tuberculous meningitis， and 57 cases of non tuberculous meningitis. The sensitivity of T-SPOT.TB in peripheral blood was 77.63%， compared with 63.16% of T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid， there was no statistically significant difference （P > 0.05）. The specificity of T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid was 98.25%， significantly higher than 84.21% of T-SPOT.TB in peripheral blood， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The positive predictive value of T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid was 97.96%， higher than 86.76% of T-SPOT.TB in peripheral blood， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The negative predictive value of T-SPOT.TB in peripheral blood was 73.85%， compared with 66.67% of T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid， there was no statistically significant difference between the results （P > 0.05）. Taking 96 SFCs/106PEMC as the cut-off value， the sensitivity， specificity， PPV， NPV and AUROC of T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid in diagnosis of tuberculous meningitis were 90.79%， 98.25%， 98.57%， 88.89% and 0.993 （95%CI： 0.982-1.000）， respectively. Conclusion Compared with T-SPOT.TB in peripheral blood， the T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid can significantly improve the specificity and PPV， and accurate diagnosis level of tuberculous meningitis.

[Key words] T-SPOT.TB； Tuberculous meningitis； Cerebrospinal fluid； Peripheral blood； Sensitivity； Specificity

結(jié)核性腦膜炎是一種嚴(yán)重的繼發(fā)性結(jié)核病，是結(jié)核分枝桿菌引起的顱內(nèi)非化膿性炎癥性疾病[1]，由于疾病所累及解剖部位的重要性和病理變化的復(fù)雜多樣性，決定了結(jié)核性腦膜炎是最嚴(yán)重的結(jié)核病，一旦誤診或漏診，往往會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重后果，造成較高的死亡率和致殘率[2]。這就需要一種微創(chuàng)甚至是無(wú)創(chuàng)、快速而又準(zhǔn)確的診斷結(jié)核性腦膜炎的方法。T-SPOT.TB以其對(duì)結(jié)核分枝桿菌獨(dú)有的敏感性和特異性被廣泛應(yīng)用于臨床[3]，目前主要用于外周血的檢測(cè)，由于結(jié)核分枝桿菌所引起的保護(hù)性免疫反應(yīng)是大量的釋放γ-干擾素的淋巴細(xì)胞趨化、聚集至感染部位，因此腦脊液的T-SPOT.TB的結(jié)果可能比外周血更準(zhǔn)確[4]。本研究在河北省胸科醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）結(jié)核內(nèi)科開展，對(duì)疑診為結(jié)核性腦膜炎的住院患者，同時(shí)進(jìn)行腦脊液及外周血的T-SPOT.TB，比較腦脊液及外周血的T-SPOT.TB對(duì)結(jié)核性腦膜炎的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月～2016年6月我院結(jié)核內(nèi)科疑診為結(jié)核性腦膜炎的住院患者147例，同時(shí)進(jìn)行腦脊液及外周血的T-SPOT.TB，根據(jù)患者的結(jié)核菌培養(yǎng)、抗酸染色以及臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、腦脊液檢查、臨床治療效果，剔除14例不能確診的病例后，將明確診斷的133例患者作為研究對(duì)象，分為結(jié)核性腦膜炎組和非結(jié)核性腦膜炎組。研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～65歲；②有腦膜刺激征或腦神經(jīng)、脊髓損害表現(xiàn)或顱內(nèi)壓增高的表現(xiàn)；③抗結(jié)核治療4周之內(nèi)；④簽署知情同意書并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有結(jié)核病病史、糖尿病、風(fēng)濕免疫病史及其他肺部疾病史；②合并艾滋病病毒感染；③妊娠；④既往有嚴(yán)重肝腎功能衰竭病史，近期（3個(gè)月）應(yīng)用免疫抑制劑及增強(qiáng)劑。分組標(biāo)準(zhǔn)：①結(jié)核性腦膜炎組：腦脊液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性或抗酸染色陽(yáng)性；有發(fā)熱、乏力、納差、盜汗、消瘦等典型的結(jié)核中毒癥狀，結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)強(qiáng)陽(yáng)性和/或結(jié)核抗體陽(yáng)性，實(shí)驗(yàn)室檢查（常規(guī)、生化）符合結(jié)核性腦脊液特點(diǎn)，抗結(jié)核治療有效；②非結(jié)核性腦膜炎組：實(shí)驗(yàn)室檢查及臨床轉(zhuǎn)歸均不支持結(jié)核性腦膜炎的診斷，可明確診斷為其他疾病，且治療原發(fā)病有效。133例研究對(duì)象知情同意進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)分組標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)核性腦膜炎組76例，其中男63例（82.89%），女13例（17.11%）；年齡18～64歲，平均（37.6±3.2）歲。非結(jié)核性腦膜炎組57例，其中男46例（80.70%），女11例（19.30%）；年齡18～61歲，平均（39.4±4.2）歲。兩組患者性別、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器

1.2.1.1 主要試劑 （1）無(wú)血清培養(yǎng)基：RPMI 1640，PPA laboratory Gmbh。AIM-VTM，Invitrogen公司。（2）PBMCs分離液：LymphoprepTM，Ads-Shield PocAS.Oslo.Norway。（3）無(wú)水乙醇（分析純），上海彤晟化工科技有限公司。（4）PBS緩沖液：1×D-PBS（catalogue number 14040-091），美國(guó)GIBCOTM公司。（5）T-SPOT.TB試劑盒，Oxford Immunotec，Abingdon，UK，包括：①微孔培養(yǎng)板：96（12×8）孔，由板條組成，外層披覆有無(wú)毒的小鼠抗人的γ干擾素單抗（INF-γ）；②抗原A（0.8 mL/瓶）：其內(nèi)含有ESAT-6抗原以及牛血清白蛋白和抑菌劑；③抗原B（0.8 mL/瓶）：其內(nèi)含有CFP-10抗原以及牛血清白蛋白和抑菌劑；④PHA對(duì)照（0.8 mL/瓶）：其內(nèi)含有用于監(jiān)控細(xì)胞活性的植物血凝素PHA以及牛血清白蛋白和抑菌劑；⑤200倍濃縮的標(biāo)記抗體（50 μL）：其內(nèi)含有堿性磷酸酶標(biāo)記的小鼠的抗人γ-干擾素單抗；⑥顯色底物溶液（25 mL）：其內(nèi)含有BCIP/NBTplus。

1.2.1.2 主要儀器 二級(jí)生物安全柜，美國(guó)Thermo Scientific公司。流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司，進(jìn)行PBMCs記數(shù)。ELISPOT分析儀，德國(guó)ADI公司，進(jìn)行斑點(diǎn)記數(shù)。37℃，90%濕度，5%CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Scientific公司。4℃冰箱BCD-257SL，青島海爾股份有限公司。超大容量低溫離心機(jī)，美國(guó)Thermo Scientific公司。臺(tái)式振蕩器Vortex-Geniez，上海易擴(kuò)儀器有限公司。電熱恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。新型全自動(dòng)恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海智城分析儀器制造有限公司。移液器，美國(guó)Thermo Scientific公司。肝素鋰真空采血管（CPT，4 mL），美國(guó)BD公司。流式標(biāo)本檢測(cè)管，美國(guó)BD公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)板，美國(guó)HYCOR生物醫(yī)學(xué)公司。

1.2.2 T-SPOT.TB（ELISPOT法）

采集受試者肝素抗凝腦脊液4 mL和肝素抗凝外周血4 mL，并由研究人員在6 h內(nèi)完成外周血及腦脊液T-SPOT.TB檢測(cè)。T-SPOT.TB檢測(cè)以AIM-VTM作為空白對(duì)照，植物血凝素（PHA）作為陽(yáng)性對(duì)照，分別以結(jié)核分枝桿菌特異性ESAT-6和CFP-10肽段庫(kù)作為刺激原。密度梯度離心分離腦脊液和外周血中單個(gè)核細(xì)胞。在預(yù)先包被抗γ干擾素（IFN-γ）單抗的微孔板上，分別加入抗原和腦脊液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞或外周血中單個(gè)核細(xì)胞（2.5×109/L），將微孔板置于37℃、90%濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育18～20 h，加入二抗及顯色底物，顯色6～8 min。將微孔板置于通風(fēng)、避光、干燥處過(guò)夜，應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定法（ELISPOT）分析儀計(jì)數(shù)斑點(diǎn)，每一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)分泌IFN-γ特異性T細(xì)胞。目視法判定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)≥20個(gè)視為實(shí)驗(yàn)有效；陰性對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)為≤5個(gè)，任一實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)-陰性孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)，認(rèn)定結(jié)果為陽(yáng)性；若陰性對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)，任一實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)≥陰性孔斑內(nèi)點(diǎn)數(shù)×2，認(rèn)定結(jié)果為陽(yáng)性；若任一實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)<20個(gè)，且陽(yáng)性對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)≥20個(gè)，認(rèn)定結(jié)果為陰性。

1.3 觀察指標(biāo)

比較腦脊液及外周血的T-SPOT.TB的陽(yáng)性率與陰性率。計(jì)算靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值。敏感度=真陽(yáng)性/（真陽(yáng)性+假陰性）×100%；特異度=真陰性/（假陽(yáng)性+真陰性）×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性/（真陽(yáng)性+假陽(yáng)性）×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性/（真陰性+假陰性）×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦脊液及外周血的T-SPOT.TB對(duì)結(jié)核性腦膜炎的診斷效能

76例診斷為結(jié)核性腦膜炎的患者中，59例外周血T-SPOT.TB檢測(cè)陽(yáng)性，外周血T-SPOT.TB檢測(cè)的敏感性為77.63%；48例腦脊液T-SPOT.TB檢測(cè)陽(yáng)性，腦脊液T-SPOT.TB檢測(cè)的敏感性為63.16%，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.82，P > 0.05）。見表1。

57例為非結(jié)核性腦膜炎的患者中，9例外周血T-SPOT.TB檢測(cè)陽(yáng)性，外周血T-SPOT.TB檢測(cè)的特異性為84.21%；1例腦脊液T-SPOT.TB檢測(cè)陽(yáng)性，腦脊液T-SPOT.TB檢測(cè)的特異性為98.25%，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.015，P < 0.05）。見表1。

外周血T-SPOT.TB檢測(cè)陽(yáng)性的患者中59例診斷為結(jié)核性腦膜炎，9例診斷為非結(jié)核性腦膜炎，外周血T-SPOT.TB檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為86.76%；腦脊液T-SPOT.TB檢測(cè)陽(yáng)性的患者中，48例診斷為結(jié)核性腦膜炎，1例診斷為非結(jié)核性腦膜炎，腦脊液T-SPOT.TB檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為97.96%，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.566，P < 0.05）。見表2。

外周血T-SPOT.TB檢測(cè)陰性的患者中17例診斷為結(jié)核性腦膜炎，48例診斷為非結(jié)核性腦膜炎，外周血T-SPOT.TB檢測(cè)的陰性預(yù)測(cè)值為73.85%；腦脊液T-SPOT.TB檢測(cè)陰性的患者中，28例診斷為結(jié)核性腦膜炎，56例診斷為非結(jié)核性腦膜炎，腦脊液T-SPOT.TB檢測(cè)的陰性預(yù)測(cè)值為66.67%，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.896，P > 0.05）。見表2。

2.2 腦脊液及外周血的T-SPOT.TB診斷結(jié)核性腦膜炎的ROC曲線

在診斷明確的76例結(jié)核性腦膜炎患者中，以病原學(xué)或臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)作為診斷結(jié)核性腦膜炎的標(biāo)準(zhǔn)，以釋放INF-γ的T細(xì)胞頻數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)繪制ROC曲線，分析診斷結(jié)核性腦膜炎的cut-off值。當(dāng)腦脊液的T-SPOT.TB的cut-off值在96 SFCs/106PEMC，診斷結(jié)核性腦膜炎的敏感性為90.79%，特異性為98.25%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為98.57%，陰性預(yù)測(cè)值為88.89%，ROC曲線下面積為0.993（95%CI：0.982～1.000）。見圖1。

3 討論

伴隨我國(guó)肺結(jié)核發(fā)病人數(shù)逐年增加，結(jié)核性腦膜炎人數(shù)也不斷增多，結(jié)核性腦膜炎早期臨床表現(xiàn)特異性差[5-6]，常被誤診為隱球菌腦膜炎、化膿性腦膜炎或病毒性腦膜炎而延誤治療，即使在抗結(jié)核藥物廣泛應(yīng)用的現(xiàn)代，其病死率及致殘率仍極高，文獻(xiàn)報(bào)道為20%～69%[7-9]。目前臨床上常見的檢測(cè)方式有結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)（PPD實(shí)驗(yàn)）、腦脊液涂片、染色、鏡檢以及外周血血象和影像學(xué)檢測(cè)等[10-13]。但確診結(jié)核性腦膜炎需要腦脊液中結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性或者涂片發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌，但腦脊液中結(jié)核菌量極少，陽(yáng)性檢出率極低，故醫(yī)療工作者迫切需要尋找一種新的、微創(chuàng)甚至是無(wú)創(chuàng)、快速而又準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)，提高結(jié)核性腦膜炎的診斷準(zhǔn)確性，改善患者預(yù)后。

T-SPOT.TB是近年來(lái)結(jié)核病診斷技術(shù)的重大突破。大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，外周血T-SPOT.TB對(duì)結(jié)核感染的診斷有較高的敏感性和特異性，但其在不同部位的結(jié)核病中敏感性不一，在結(jié)核高流行地區(qū)特異性不佳，不能區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核和潛伏結(jié)核感染，使其臨床應(yīng)用受限[14]。由于結(jié)核性腦膜炎的發(fā)生是結(jié)核分枝桿菌及其特異性抗原與致敏的CD4+T細(xì)胞為主的相互作用的過(guò)程，腦脊液中的各種細(xì)胞因子，例如IFN-γ、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等水平均顯著高于外周血，局部病變呈現(xiàn)隔室化反應(yīng)[15]，這種反應(yīng)使得抗原特異性T細(xì)胞向病變部位聚集，外周血抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量減少，從而使結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液中效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量與外周血相比可能增高。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)腦脊液T-SPOT.TB診斷結(jié)核性腦膜炎的研究逐漸增多，韓國(guó)的Kim等[16]首先對(duì)腦脊液與外周血T-SPOT.TB診斷結(jié)核性腦膜炎的價(jià)值進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示腦脊液與外周血T-SPOT.TB對(duì)診斷結(jié)核性腦膜炎的敏感性為75%和91%。本研究也顯示外周血T-SPOT.TB對(duì)診斷結(jié)核性腦膜炎的敏感性高于腦脊液，但二者比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此后Thomas等[17]的研究也表明腦脊液T-SPOT.TB能早期診斷結(jié)核性腦膜炎。近期國(guó)內(nèi)李雪蓮等[18]的研究也表明腦脊液T-SPOT.TB診斷結(jié)核性腦膜炎的特異性較高，而外周血T-SPOT.TB檢測(cè)的敏感性較高，與其他國(guó)內(nèi)既往研究結(jié)果[19]一致。本研究也顯示在結(jié)核性腦膜炎患者中，腦脊液T-SPOT.TB的特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均高于外周血，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可見腦脊液T-SPOT.TB能夠更加準(zhǔn)確地診斷結(jié)核性腦膜炎。這彌補(bǔ)了外周血T-SPOT.TB檢測(cè)的不足[20]。目前外周血T-SPOT.TB無(wú)法確定一個(gè)理想的cut-off值來(lái)鑒別活動(dòng)性結(jié)核病和潛伏結(jié)核感染，但當(dāng)腦脊液的T-SPOT.TB的cut-off值在96 SFCs/106PEMC，診斷結(jié)核性腦膜炎的敏感性和特異性均在90%以上。腦脊液的T-SPOT.TB檢測(cè)有望彌補(bǔ)外周血T-SPOT.TB特異性偏低的缺點(diǎn)，使其用于結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家對(duì)結(jié)核性腦膜炎的早期診斷變得可能，但這仍需大樣本量的研究來(lái)驗(yàn)證。

綜上所述，與外周血的T-SPOT.TB相比，腦脊液的T-SPOT.TB可大幅提高對(duì)結(jié)核性腦膜炎的特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，可顯著提高結(jié)核性腦膜炎的診斷水平。

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