新疆和田玫瑰花瓣的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)初步研究

陳長(zhǎng)春 陳嘉媛 龐戰(zhàn) 霍仕霞

[摘要] 目的 建立和田玫瑰花瓣藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為控制該藥材的質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 參照2015年版《中國(guó)藥典》通則相關(guān)方法，對(duì)該藥材總灰分、酸不溶性灰分和浸出物進(jìn)行測(cè)定；采用薄層色譜法，以槲皮素為對(duì)照，對(duì)該藥材進(jìn)行定性鑒別；采用RT-HPLC法，以甲醇-0.1%磷酸（56∶44）為流動(dòng)相，對(duì)玫瑰花瓣中的槲皮素含量進(jìn)行測(cè)定。 結(jié)果 該藥材薄層鑒別方法具有專屬性，總灰分平均為4.9%，酸不溶性灰分平均為0.19%，浸出物為45.8%。槲皮素的含量平均值為0.21%。 結(jié)論 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步建立了和田玫瑰花藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，所建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可用于該產(chǎn)地玫瑰花瓣的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 玫瑰花瓣；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；槲皮素；鑒別

[中圖分類號(hào)] R284.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）06（a）-0025-05

[Abstract] Objective To establish a quality standard for rose petals of Hetian， and provide experimental basis for the quality control of the medicinal materials. Methods According to the general principles of Chinese pharmacopoeia in 2015 the total ash content， acid insoluble ash and extract were determined. TLC method was used to identify the crude drug with quercetin as the reference. The content of quercetin in rose petals was determined by RT-HPLC with methanol-0.1% phosphoric acid （56∶44） as the mobile phase. Results The method of TLC had specificity， the total ash was 4.9% in average， the acid insoluble ash was 0.19% in average， and the extract was 45.8% in average. The average content of quercetin was 0.21%. Conclusion According to the experimental results， a quality standard for rose petals is established preliminarily， and the quality standard of the medicinal plants can be used for the quality control of rose petals of Hetian.

[Key words] Rose petals； Quality standard； Quercetin； Identification

玫瑰花瓣在我國(guó)已有兩千余年的藥用歷史，是常用的理氣藥，具有理氣解郁、舒肝鎮(zhèn)痛、收斂止瀉、和血調(diào)經(jīng)等作用，用于肝胃氣痛、食少嘔惡、月經(jīng)不調(diào)、跌撲傷痛等，尤其是對(duì)心血管疾病、各種炎癥、腫瘤及糖尿病等具有良好的治療作用；現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，玫瑰花瓣還有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化作用，其藥用價(jià)值已引起國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥專家的普遍重視[1-6]。玫瑰花瓣中含有豐富的黃酮類化合物，主要是槲皮素和沒食子酸等[7]。目前新疆藥材市場(chǎng)供應(yīng)的玫瑰花瓣為新疆和田地區(qū)傳統(tǒng)栽培品種，收載于《新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)》。突厥薔薇科植物突厥薔薇（Rosa damascene Mill.）玫瑰花瓣為維吾爾醫(yī)常用藥材，且90%以上的藥材都來(lái)源于新疆和田地區(qū)玫瑰花基地；該產(chǎn)地所產(chǎn)的玫瑰花瓣雖然收載于維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)里，但該標(biāo)準(zhǔn)中僅有關(guān)于性狀、雜質(zhì)的記錄，目前也未見有關(guān)于和田產(chǎn)地的玫瑰花瓣的質(zhì)量研究。本研究采用傳統(tǒng)與現(xiàn)代分析技術(shù)相結(jié)合的方法，對(duì)玫瑰花進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)基礎(chǔ)研究，對(duì)其所含有的黃酮類成分槲皮素進(jìn)行了研究，建立了槲皮素的含量測(cè)定方法，以利于進(jìn)一步控制其質(zhì)量，進(jìn)而為和田玫瑰花瓣的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津高效液相色譜儀：LC-20AB泵，SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器，CBM-20A系統(tǒng)控制器，CTO-20A柱溫箱，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，DGU-20A3在線脫氣裝置，SQP-224-1CN天平（萬(wàn)分之一天平，賽多利斯學(xué)儀器有限公司）。DZKW型電熱恒溫水浴鍋（北京永光明醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑

玫瑰花瓣（經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院艾尼瓦爾主任鑒定為和田產(chǎn)玫瑰花瓣，10批玫瑰花瓣批號(hào)分別為H30033426、H30033517、H30034618、H30 034719、H30034810、H30034728、H30035411、H300355 19、H30035614、H30035622，均購(gòu)自和田麥迪森飲片有限公司），甲醇（色譜純，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）。槲皮素購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)：10081-2）。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材性狀及理化鑒定

花或花蕾略呈球形、卵形或不規(guī)則團(tuán)塊，直徑1.5～2.0 cm?；ㄍ袎匦位虬肭蛐?，與花萼基部相連，花托無(wú)宿?；蛴卸趟薰?。萼片5枚，披針形，黃綠色至棕綠色，伸展或向外反卷，其內(nèi)表面（上表面）被細(xì)毛，顯凸起的中脈?；ò?片或重瓣，廣卵圓形，多皺縮，紫紅多線期，少數(shù)黃棕色。雄蕊多數(shù)。黃褐色，著生于托托周圍。體輕，質(zhì)脆。香氣濃郁，味微苦澀。

取本品粗粉2 g，加乙醚20 mL，振搖浸泡1 h，濾過。取濾液2 mL，置蒸發(fā)皿中，揮干乙醚，滴加數(shù)滴5%香草醛濃硫酸液，濾液即顯紫紅色。

2.2 薄層色譜鑒別

取本品粉末1 g，加80%甲醇50 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?乙醚（1∶1）混合溶液6 mL，使溶解，靜置分層，棄去乙醚液，水液加乙醚提取2次，每次20 mL，棄去乙醚液，水液加鹽酸5 mL，置水浴中水解1 h，取出，迅速冷卻，用乙醚提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，用水30 mL洗滌，棄去水液，乙醚液揮干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取槲皮素對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液10 μL、對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄展板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶4.5∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，在105℃加熱數(shù)分鐘，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同頻色的熒光斑點(diǎn)，左側(cè)為對(duì)照品，右側(cè)為樣品。見圖1。

2.3 檢查與浸出物

①總灰分：取本品細(xì)粉4 g，精密稱定，置熾灼至恒重的坩堝中，灼燒至灰化，并于500～600℃熾灼至恒重，計(jì)算出總灰分。平行進(jìn)行10個(gè)批次的總灰分測(cè)定，平均總灰分為4.94%。②酸不溶性灰分：取總灰分項(xiàng)下的殘?jiān)?，加稀鹽酸10 mL，水浴加熱10 min，用無(wú)灰濾紙濾過，用水洗滌殘?jiān)料匆翰伙@氯化物反應(yīng)為止，殘?jiān)鼰胱浦梁阒?，?jì)算出酸不溶性灰分。平行進(jìn)行10個(gè)批次的酸不溶性測(cè)定，平均酸不溶性灰分為0.19%。③浸出物測(cè)定。取本品4 g，精密加入20%乙醇100 mL，靜置1 h，再加熱回流1 h，放冷，濾過，精密吸取續(xù)濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，蒸干，于105℃干燥3 h，計(jì)算出浸出物的量。平行進(jìn)行10個(gè)批次的浸出物測(cè)定，平均浸出物為45.92%[8]。

2.4 藥材提取及檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 色譜條件

色譜條件：YMC-Triart C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇（A）∶水（B）=56∶44，流速：1.0 mL/min，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：374 nm。

2.4.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取槲皮素對(duì)照品適量，制備成濃度為2.02 mg/mL的對(duì)照品母液，再加甲醇制成每1 mL含101.0 μg的溶液，即得。

2.4.3 供試品溶液的制備

取玫瑰花瓣細(xì)粉約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1.5 h，放冷再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，精密加入50%鹽酸溶液7 mL，至80℃水浴鍋中水解30 min，取出，迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得，具體方法及結(jié)果如下：

2.4.3.1 不同提取方法對(duì)槲皮素含量的影響 取玫瑰花瓣細(xì)粉約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，平行6份，精密加入80%甲醇50 mL，稱定重量，3份一組，分別采用回流提取法、超聲提取法提取1.5 h，放冷再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，精密加入50%鹽酸溶液7 mL，至85℃水浴鍋中水解30 min，取出，迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得，回流提取藥材含量為0.26%，超聲提取藥材含量為0.26%。由本次HPLC分析結(jié)果可知，超聲與回流對(duì)玫瑰花瓣中槲皮素提取影響相差不大，但超聲操作較回流方便易行，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇超聲提取。

2.4.3.2 不同提取溶劑對(duì)槲皮素含量的影響 取玫瑰花瓣細(xì)粉約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，平行9份，3份一組，分別采用甲醇、70%甲醇、70%乙醇50 mL，稱定重量后超聲1.5 h，放冷再次稱定，用80%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，精密加入50%鹽酸溶液7 mL，至85℃水浴鍋中水解30 min，取出，迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得，甲醇提取藥材含量為0.26%，80%甲醇提取藥材含量為0.23%，80%乙醇提取的藥材含量為0.24%。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，甲醇提取槲皮素含量?jī)?yōu)于其他兩種提取溶劑，故最佳提取溶劑為甲醇。

2.4.3.3 不同提取時(shí)間對(duì)槲皮素含量的影響 取玫瑰花瓣細(xì)粉約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，平行9份，3份一組，分別加入甲醇50 mL，稱定重量后三組分別超聲0.5、1.0、2.0 h，放冷再次稱定，用80%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，精密加入50%鹽酸溶液7 mL，至85℃水浴鍋中水解30 min，取出，迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得，超聲0.5 h藥材含量為0.25%，超聲1 h藥材含量為0.26%，超聲1.5 h藥材含量為0.25%。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，超聲提取時(shí)間對(duì)玫瑰花瓣中槲皮素的提取影響不是很大，為保證玫瑰花瓣中槲皮素提取完全，選擇超聲時(shí)間為1 h。

2.4.3.4 不同溶劑用量對(duì)槲皮素含量的影響 取玫瑰花瓣細(xì)粉約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，平行9份，3份一組，分別加入甲醇30、50、80 mL，稱定重量后超聲1.0 h，放冷再次稱定，用80%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，精密加入50%鹽酸溶液7 mL，至85℃水浴鍋中水解30 min，取出，迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得，加入甲醇30 mL藥材含量為0.27%，加入甲醇50 mL藥材含量為0.26%，加入甲醇80 mL藥材含量為0.24%。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，加入甲醇量為30 mL時(shí)，即可將槲皮素提取完全，故選擇溶劑用量為30 mL。

2.4.3.5 不同鹽酸濃度對(duì)槲皮素含量的影響 取玫瑰花瓣細(xì)粉約20 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，稱定重量后超聲1.0 h，放冷再次稱定，用80%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，平行9份，3份一組，每組分別加入等體積7 mL 25%、50%、75%鹽酸水溶液水解，至85℃水浴鍋中水解30 min，取出，迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得，加入25%鹽酸藥材含量為0.27%，加入50%鹽酸藥材含量為0.26%，加入75%鹽酸藥材含量為0.25%。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，25%鹽酸水解，即可水解完全，故選用25%鹽酸水解。

2.4.3.6 不同鹽酸用量對(duì)槲皮素含量的影響 取玫瑰花瓣細(xì)粉約20 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，稱定重量后超聲1.0 h，放冷再次稱定，用80%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，平行9份，3份一組，每組分別加入5、7、9 mL，25%鹽酸水溶液水解，至85℃水浴鍋中水解30 min，取出，迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得，加入5 mL鹽酸藥材含量為0.24%，加入7 mL鹽酸藥材含量為0.26%，加入9 mL鹽酸藥材含量為0.22%。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，鹽酸用量為7 mL時(shí)，藥材中的槲皮素含量較高，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)鹽酸用量采用7 mL。

2.4.3.7 不同水浴溫度對(duì)槲皮素含量的影響 取玫瑰花瓣細(xì)粉約20 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，稱定重量后超聲1.0 h，放冷再次稱定，用80%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，平行9份，3份一組，每組加入7 mL 25%鹽酸水溶液水解，三組分別于80℃、85℃、90℃條件下水解30 min，取出，迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得，80℃藥材含量為0.25%，85℃藥材含量為0.24%，90℃藥材含量為0.24%。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，水浴溫度為80℃時(shí)，槲皮素峰面積較水浴溫度85、90℃時(shí)峰面積大，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)水浴溫度采用80℃。

2.4.3.8 不同鹽酸水解時(shí)間對(duì)槲皮素含量的影響 取玫瑰花瓣細(xì)粉約20 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，稱定重量后超聲1.0 h，放冷再次稱定，用80%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，平行9份，3份一組，每組加入7 mL 25%鹽酸水溶液水解，80℃條件下三組分別水解30、60、90 min，取出，迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得，水解30 min藥材含量為0.24%，水解60 min藥材含量為0.26%，水解90 min藥材含量為0.26%。結(jié)果表明水解時(shí)間增加，水解效果并沒有持續(xù)增加，水解60 min，即可水解完全[9-23]。

2.5 線性關(guān)系比較

精密量取“對(duì)照品溶液制備”中對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，置10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻。在“色譜條件”色譜條件下進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)，槲皮素峰面積值為縱坐標(biāo)，槲皮素在5.05～80.80 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。求得回歸方程為：y = 39586x + 79783，r = 0.9997。見圖2。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.4.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，RSD值為0.16%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.4.3”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、24、48 h時(shí)進(jìn)樣10 μL測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算RSD，RSD值為1.32%，表明樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品適量，共6份，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品RSD分別為0.86%（n = 6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密取已知含量的樣品適量，共9份，分別精密加入質(zhì)量濃度為2.02 mg/mL的槲皮素對(duì)照品母液1、1.25、1.5 mL，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。見表1。

2.10 樣品含量測(cè)定

對(duì)下列10個(gè)不同批號(hào)和廠家的玫瑰花瓣分別按照“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)色譜條件，測(cè)定樣品中槲皮素的含量[24-25]。見表2。

3 討論

供試品溶液的制備研究中，根據(jù)槲皮素的理化性質(zhì)，對(duì)供試品的提取方法（超聲、回流）、提取溶劑（甲醇、80%甲醇、80%乙醇）、溶劑用量（30、50、80 mL）、提取時(shí)間（0.5、1、1.5 h）、鹽酸濃度（25%、50%、75%）和鹽酸用量（5、7、9 mL）進(jìn)行了考察和分析，以槲皮素的含量為考察指標(biāo)，確定了文中測(cè)定玫瑰花瓣中槲皮素的供試品溶液制備方法，提示該提取方法可行。

本研究采用甲醇（A）∶水（B）=56∶44，流速：1.0 mL/min，柱溫：30℃的色譜條件，由本研究結(jié)果可看出，經(jīng)過酸解的玫瑰花瓣提取物中槲皮素含量高于未水解樣，水解后的提取物中黃酮苷類苷元主要為槲皮素，這對(duì)玫瑰花瓣中黃酮醇苷含量測(cè)定方法的建立有參考價(jià)值。因此本研究?jī)H以槲皮素為對(duì)照品對(duì)玫瑰花瓣提取物進(jìn)行測(cè)定，其他成分由于缺乏相應(yīng)對(duì)照品仍不能準(zhǔn)確定性與定量。

總之，本研究所建立的測(cè)定方法排除了玫瑰花瓣中所含色素和其他多酚物質(zhì)產(chǎn)生的干擾，簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速，且方法學(xué)考察表明，精密度、檢測(cè)限、加樣回收率的范圍均符合要求，為和田地區(qū)玫瑰花瓣質(zhì)量控制提供了準(zhǔn)確可行的依據(jù)。通過對(duì)10批和田產(chǎn)地的玫瑰花瓣（采收期一致）進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明固定采收期后，和田玫瑰花瓣中有效成分槲皮素的含量差異較小，可作為含玫瑰花瓣藥材的藥物開發(fā)的可持續(xù)利用資源。

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