劉學(xué)剛 劉艷彩 吳春平 李景光 趙嶺嶺 張振亞

[摘要] 目的 探究CD151對(duì)結(jié)腸癌中Wnt信號(hào)通路變化的影響。 方法 采用Western blot方法分別檢測(cè)正常結(jié)腸癌細(xì)胞（HT29）、CD151基因敲除的結(jié)腸癌細(xì)胞（CD151--HT29）中CD151、LRG-1以及LGR-5蛋白的表達(dá)情況；采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)HT29、CD151--HT29細(xì)胞中LRG-1以及LGR-5基因的表達(dá)情況；考察HT29、CD151--HT29細(xì)胞的侵襲能力。 結(jié)果 HT29細(xì)胞中存在明顯的CD151、LRG-1以及LGR-5蛋白表達(dá)，而CD151--HT29細(xì)胞中并無CD151蛋白的表達(dá)，且可以觀察到LRG-1以及LGR-5蛋白表達(dá)量明顯下降；實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，與HT29細(xì)胞比較，CD151--HT29細(xì)胞中的LRG-1以及LGR-5基因表達(dá)顯著下降（P < 0.05）；細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)可見，HT29細(xì)胞侵襲能力強(qiáng)于CD151--HT29細(xì)胞（P < 0.05）。 結(jié)論 CD151基因的缺失能夠抑制Wnt信號(hào)通路的起始蛋白LRG-1、LGR-5的表達(dá)，并且能夠下調(diào)癌細(xì)胞侵襲能力，提示CD151基因?qū)nt信號(hào)通路存在一定調(diào)控作用，這為結(jié)腸癌聯(lián)合靶向治療提供了一定的科學(xué)指導(dǎo)。

[關(guān)鍵詞] CD151；結(jié)腸癌；Wnt信號(hào)通路

[中圖分類號(hào)] R735.25 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）06（a）-0013-04

[Abstract] Objective To explore the effect of CD151 on the changes of Wnt signaling pathway in colon cancer. Methods Western blot method was used to detect colon cancer cells （HT29） and CD151 gene knockout colon cancer cells （CD151--HT29） in CD151， LRG-1 and LGR-5 protein expression； the expression of LRG-1 HT29， CD151--HT29 cells and LGR-5 gene were detected by real-time quantitative PCR technique； the invasion ability of HT29， CD151--HT29 cells was inspected. Results The results showed that there was CD151， LRG-1 and LGR-5 protein expression in HT29 cells， but no CD151 protein expression in CD151--HT29 cells， and significantly decrease could be observed in the expression of LRG-1 and LGR-5 protein； real-time quantitative PCR results showe that， compared with HT29 cells， the expression of LRG-1 and LGR-5 gene in CD151--HT29 cells decreased significantly （P < 0.05）. Cell invasion assay showed that HT29 cell invasion ability was stronger than that in CD151--HT29 cells （P < 0.05）. Conclusion The expression of CD151 gene deletion can inhibit Wnt signaling initiation protein LRG-1 and LGR-5， and decrease the cancer cell invasion， which indicates that the CD151 gene has some role in the regulation of Wnt signaling pathway， to provide some scientific guidance for the colorectal cancer combined with targeted therapy.

[Key words] CD151； Colorectal cancer； Wnt signaling pathway

結(jié)腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，盡管我們已經(jīng)在結(jié)腸癌的發(fā)生與發(fā)展上取得了重大突破，但是對(duì)于晚期的腫瘤轉(zhuǎn)移仍然束手無策，而腫瘤轉(zhuǎn)移恰恰正是結(jié)腸癌復(fù)發(fā)率高、治愈率低的主要原因[1-2]。眾所周知腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的、多步驟的過程，目前可以確定的是，腫瘤轉(zhuǎn)移與腫瘤內(nèi)部的腫瘤干細(xì)胞存在密切聯(lián)系[3]，而Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是腫瘤干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)自我更新以及分化功能的重要信號(hào)通路[4]，其中LRG-1和LGR-5蛋白是Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要參與組成，均能夠促進(jìn)腫瘤血管的生成，并參與多種腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，CD151作為TM4SF家族中唯一的癌基因，在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中大量表達(dá)，具有穩(wěn)定新生血管的能力[7]。為探究CD151對(duì)結(jié)腸癌中Wnt信號(hào)通路的變化影響，本研究分別比較人結(jié)腸癌細(xì)胞（HT29）、敲除CD151基因的HT29細(xì)胞（CD151--HT29）中Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路靶基因CD151、LRG-1以及LGR-5蛋白的表達(dá)情況，LRG-1和LGR-5基因轉(zhuǎn)錄情況，以及兩種細(xì)胞的侵襲能力，以期為臨床上聯(lián)合靶向治療結(jié)腸癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

本實(shí)驗(yàn)主要涉及Western blot、實(shí)時(shí)定量PCR以及細(xì)胞侵襲四大部分實(shí)驗(yàn)，主要試劑如下：DEME培養(yǎng)基（杭州四季青生物工程材料有限公司）；胰蛋白酶（上海源葉生物科技有限公司）；BCA蛋白分析試劑盒（Thermo公司）；LRG-1、LGR-5、β-acting抗體（美國Abcam公司）；熒光二抗（華拓生物科技股份有限公司）；Trizol裂解液（美國invitrogen公司）；Matrigel膠（美國Becton-dickinson公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HT29、CD151--HT29放入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，以含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。待細(xì)胞長滿時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基除去，使用PBS溶液清洗2～3次，再加入1 mL胰酶進(jìn)行細(xì)胞消化5 min后，加入培養(yǎng)基稀釋胰酶停止消化，使用吹打管吹打培養(yǎng)基將培養(yǎng)瓶壁上的細(xì)胞吹打至培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管內(nèi)離心5 min后，將含有胰酶的培養(yǎng)基導(dǎo)入廢液缸內(nèi)，重新導(dǎo)入培養(yǎng)基，用吹打管將細(xì)胞吹打均勻，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中。取正處于生長期的細(xì)胞備用。

1.2.2 Western blot技術(shù) 待細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的細(xì)胞長滿約80%時(shí)，將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基倒入廢液缸內(nèi)，使用PBS溶液清洗2～3次放于冰上，加入4 mL細(xì)胞裂解液（內(nèi)含100 μL PMSF/mL），搖勻，放置在冰上裂解30 min后，用細(xì)胞刮將細(xì)胞輕輕刮下，將細(xì)胞裂解液與細(xì)胞碎片轉(zhuǎn)移至離心管中，12 000 r/min離心5 min后取上清，使用BCA定量試劑盒測(cè)定上清液中所含蛋白濃度，確定并統(tǒng)一SDS-PAGE凝膠電泳上樣量。

取30 μg樣品蛋白與5倍體積的緩沖溶液混合煮沸10 min，上樣，80 V恒溫電壓跑膠3～4 h。電泳結(jié)束后交分離膠小心取下，放入置轉(zhuǎn)膜液中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。使用ECL發(fā)光試劑盒滴加到轉(zhuǎn)好膜的PVDF膜上，作用5 min后用濾紙吸掉多余發(fā)光試劑，在暗室中根據(jù)PVDF膜的大小裁剪出適當(dāng)大小的X線感光膠片進(jìn)行曝光。將曝光后的膠片放入凝膠成像分析系統(tǒng)中進(jìn)行分析，使用Quantity One圖像分析軟件分析目標(biāo)條帶的分子量和光密度值。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù) 分別將處于對(duì)數(shù)生長期的HT29、CD151--HT29細(xì)胞，加入1 mL Trizol，待細(xì)胞裂解后收集至1.5 mL Ep管中，混勻，離心，取上清液置入新的Ep管內(nèi)，加入200 μL氯仿，搖勻，靜置15 min后，離心，小心取出上層水相，加入等體積的異丙醇，搖勻，可以隱約看到有白色絮狀RNA出現(xiàn)，離心，棄去上清，保留白色沉淀，將提取出來的總RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA文庫。根據(jù)NCBI Gene Bank內(nèi)提供的基因序列，LRG-1和LGR-5上下游引物序列如表1所示。將引物用ddH2O溶解，配成終濃度為10 pmol/μL，于-20℃凍存，備用。各引物均取出2.0 μL，加入至PCR體系：3.0 μL cDNA，5.0 μL 5×PCR Buffer，0.5 μL MgCl2，2.0 μL上游引物，2.0 μL下游引物，12.3 μL ddH2O，總體積為25 μL，進(jìn)行PCR反應(yīng)。于94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸60 s，40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物立即進(jìn)行電泳，最終用2-△△CT法計(jì)算目的基因的表達(dá)量。

1.2.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigel膠用同樣體積的不完全培養(yǎng)基稀釋后，加入至細(xì)胞小室中搖晃，使Matrigel膠平鋪在細(xì)胞小室底部，37℃成膠30 min。將準(zhǔn)備好的細(xì)胞小室放入至24孔培養(yǎng)板中，分別在小室內(nèi)加入含有1×105個(gè)HT29、CD151--HT29細(xì)胞，再在小室外加入600 μL培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出細(xì)胞小室，棄去小室外培養(yǎng)基，使用生理鹽水以及棉簽小心擦去Matrigel膠，在倒置顯微鏡下觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種腫瘤細(xì)胞中CD151、LRG-1以及LGR-5蛋白的表達(dá)情況

采用Western blot方法分別檢測(cè)HT29、CD151--HT29細(xì)胞中CD151、LRG-1以及LGR-5蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在HT29細(xì)胞中CD151存在明顯表達(dá)，而在CD151--HT29細(xì)胞中未檢測(cè)出CD151蛋白，在HT29細(xì)胞中LRG1與參比蛋白β-actin的比值為（0.11±0.02），顯著高于CD151--HT29細(xì)胞中的LRG1與參比蛋白β-actin的比值（0.06±0.02）（t = 3.995，P = 0.016）；在HT29細(xì)胞中LGR5與參比蛋白β-actin的比值為（0.13±0.03），顯著高于CD151--HT29細(xì)胞中的LGR5與參比蛋白β-actin的比值（0.06±0.02）（t = 3.834，P = 0.019）。見圖1。

2.2 兩種腫瘤細(xì)胞中LRG-1和LGR-5基因轉(zhuǎn)錄情況

采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)HT29和CD151--HT29細(xì)胞中LRG-1以及LGR-5基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示HT29細(xì)胞中LRG-1基因的轉(zhuǎn)錄水平為（1.00±0.02），CD151--HT29細(xì)胞中LRG-1基因的轉(zhuǎn)錄水平為（0.55±0.01），HT29細(xì)胞LRG-1基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于CD151--HT29細(xì)胞（t = 42.375，P = 0.000）；HT29細(xì)胞中LGR-5基因的轉(zhuǎn)錄水平為（1.00±0.02）、CD151--HT29細(xì)胞中LGR-5基因的轉(zhuǎn)錄水平為（0.62±0.02），HT29細(xì)胞LGR-5基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于CD151--HT29細(xì)胞（t = 31.002，P = 0.000）。見圖2。

2.3 兩種腫瘤細(xì)胞侵襲能力

采用構(gòu)建細(xì)胞小室的方法檢測(cè)HT29、CD151--HT29細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果顯示常規(guī)培養(yǎng)24 h后，HT29細(xì)胞侵襲人工基底濾膜的細(xì)胞數(shù)（246.33±21.55）明顯多于CD151--HT29細(xì)胞（97.67±14.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 10.018，P < 0.001）。見圖3。

3 討論

近年來，隨著我國人民生活水平的提高以及飲食、環(huán)境的變化，我國結(jié)腸癌發(fā)病率正在逐年升高。傳統(tǒng)的手術(shù)治療以及化學(xué)、放射療法并不能發(fā)揮理想的治療效果，治療后仍然存在癌癥高轉(zhuǎn)移率以及高復(fù)發(fā)率，目前現(xiàn)有的科學(xué)研究水平尚不能完全解釋腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制[8]。早期的研究表明，CD151能夠通過維持血管上皮細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)之間的正常黏附，從而維持新生血管的穩(wěn)定性以及通透性，是病理性血管形成的必要條件[9-10]。為了能夠更好地探究CD151調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制，有學(xué)者將目光轉(zhuǎn)向Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活也是腫瘤轉(zhuǎn)移的必要條件之一[11]，而CD151與Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的關(guān)系尚少見報(bào)道。本研究通過比較HT29和CD151--HT29兩種細(xì)胞中Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯情況，探究CD151對(duì)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控。

CD151是一種膜蛋白，廣泛分布于各種細(xì)胞表面，結(jié)構(gòu)上具有兩個(gè)細(xì)胞外環(huán)、兩個(gè)細(xì)胞內(nèi)末端（-COOH/-NH2）的特征，這些特征賦予了CD151能夠與細(xì)胞表面多種蛋白質(zhì)結(jié)合的能力，因此CD151在眾多生理活動(dòng)過程中扮演著十分重要的角色[12-13]，研究表明，CD151蛋白高表達(dá)的癌癥患者的存活率顯著低于CD151蛋白表達(dá)低的癌癥患者[14]，證明了CD151蛋白在癌癥的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮著重要的作用。CD151主要是通過與整合素形成穩(wěn)定的復(fù)合體，調(diào)節(jié)細(xì)胞吸附以及遷移能力[15]。本研究結(jié)果顯示，CD151--HT29細(xì)胞中的LRG-1和LGR-5基因無論是轉(zhuǎn)錄階段還是在翻譯階段均受到抑制，發(fā)生下調(diào)，并且缺失CD151基因的癌癥細(xì)胞的細(xì)胞侵襲能力減弱。

LRG-1蛋白LGR-5蛋白均是Wnt信號(hào)通路的靶蛋白，其中LRG-1蛋白能夠促進(jìn)腫瘤血管的生成，在正常組織中卻少有表達(dá)[16]，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的表達(dá)；LGR-5蛋白是腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)，研究表明，VEGF能夠促進(jìn)腫瘤血管的生成，增強(qiáng)腫瘤血管通透性，促進(jìn)腫瘤淋巴管的生長，以及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的耐受性，并且VEGF在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用[17-18]。LGR-5主要是與Wnt信號(hào)通路的起始蛋白Wnt蛋白結(jié)合，發(fā)揮激活Wnt信號(hào)通路的作用，使得Wnt信號(hào)通路的核心蛋白β-catenin蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積聚，當(dāng)LGR-5正常表達(dá)時(shí)，β-catenin蛋白的生成與降解同時(shí)存在，β-catenin蛋白濃度維持在一個(gè)較低水平，目前多項(xiàng)研究表明在結(jié)腸癌細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)量顯著上升[19-20]。

綜上所述，CD151很可能是Wnt信號(hào)通路上游調(diào)控因子，通過調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，這很可能會(huì)為臨床上治療結(jié)腸癌提供一個(gè)新的突破點(diǎn)。

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