吳劍平，謝 倩，陳 林，張軍峰，史麗云，詹 瑧

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023)

銀屑病是以皮膚反復(fù)出現(xiàn)炎性增生為典型表現(xiàn)的自身免疫性疾病，目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[1-2]。咪喹莫特作為Toll樣受體激動劑，可通過與TLR-7/8結(jié)合，誘導(dǎo)皮膚出現(xiàn)表皮增厚、棘層肥厚、角化不全、嗜中性粒細(xì)胞聚集等銀屑病樣表現(xiàn)，目前常被用于銀屑病動物模型的誘導(dǎo)劑[3]。BALB/c和C57BL/6小鼠是目前最常用于該類動物模型研究的兩種小鼠品系，但這兩種模型有無差異，哪種模型更適用于人類銀屑病研究則鮮見報道。本研究即采用BALB/c和C57BL/6兩種小鼠品系，比較不同時間點(diǎn)咪喹莫特誘導(dǎo)的兩種模型小鼠皮膚形態(tài)學(xué)、病理組織學(xué)等方面的差異，并探討IL-23/IL-17炎癥軸在模型進(jìn)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠各24只，均為雌性，體重20～22 g， 7～8周齡，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司南京分公司提供[SCXK (蘇) 2016-0003]。實驗期間小鼠均飼養(yǎng)在屏障環(huán)境[SYXK (蘇) 2014-0001]中，按照國標(biāo)GB 14925-2010[4]的有關(guān)要求控制環(huán)境參數(shù)。實驗前先給予3 d健康適應(yīng)期，飼養(yǎng)和實驗期間動物自由飲食。

1.2 主要試劑與儀器

明欣利迪乳膏(5%咪喹莫特)購自四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司；SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix購自Invitrogen公司；實時熒光定量PCR引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Power SYBR? Green PCR Master Mix購自Applied Biosystems公司。Olympus顯微鏡購自日本；CFX384多重實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組處理

咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型觀察期多為4～6 d[3, 5-6]，故本研究選擇6 d作為模型觀察終點(diǎn)。BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠均隨機(jī)分為4組，每組6只，分別為涂藥0 d組(即正常對照組)、涂藥2 d組、涂藥4 d組和涂藥6 d組。

各組處理如下：動物于涂藥前一天背部剃毛，形成約2 cm × 3 cm大小的皮膚暴露區(qū)。涂藥組小鼠每天涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg，并分別于涂藥后2 d(涂藥2 d組)、4 d(涂藥4 d組)、6 d(涂藥6 d組)采樣。涂藥0 d組小鼠背部剃毛后，不做任何處理，第2天直接采樣。采樣時小鼠先頸椎脫臼處死，剪下背部涂藥部位皮膚，分成兩塊，一塊放入10%甲醛中固定，另一塊放入-80℃凍存。本實驗研究的IACUC號為ACU170704，實驗過程中嚴(yán)格按照實驗動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.3.2 皮損嚴(yán)重程度(psoriasis area and severity index，PASI)評分

PAIS評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0，無；1，輕度；2，中度；3，重度；4，極重度。采用相機(jī)每天拍照記錄小鼠皮損情況，同時按PAIS標(biāo)準(zhǔn)對皮膚紅斑(erythema)、鱗屑(scales)及浸潤增厚程度(thickness)進(jìn)行0～4的評分，將3種積分累計得到總積分。繪制各組小鼠積分變化趨勢圖，觀察各組小鼠皮損的變化情況。

1.3.3 皮損病理組織學(xué)檢測

HE染色觀察小鼠皮膚有無變性、壞死、潰瘍、痂皮形成，上皮層有無增厚、表面角化不全或角化過度、真皮或皮下組織內(nèi)有無充血、水腫、炎細(xì)胞浸潤等病變。之后在200倍光鏡下，采用計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(DP2-BSW)測量每只動物的表皮層厚度。

1.3.4 實時熒光定量PCR檢測

采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)法測定各組小鼠皮膚組織IL-23/IL-17軸相關(guān)免疫因子IL-23、IL-17A和IL-17F mRNA的相對表達(dá)量。以β-actin為內(nèi)參，實驗結(jié)果采用2-△△Ct法進(jìn)行相對定量。各引物序列如下：IL-23(上游)：5’-AACAACAGCTCGGATTTGGTAT-3’；IL-23(下游)：5’-ATGACCAGGACATTCAGCAGT-3’；IL-17A(上游)：5’-TCAGCGTGTCCAAACACTGAG-3’；IL-17A(下游)：5’-CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT-3’；IL-17F(上游)：5’-TGCTACTGTTGATGTTGGGAC-3’；IL-17F(下游)：5’-CAGAAATGCCCTGGTTTTGGT-3’；β-actin(上游)：5’-CTGAGAGGGAAATCGTG CGTGAC-3’；β-actin(下游)：5’-GAACCGCTCG TTGCCAATAGTGAT-3’。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組背部皮膚形態(tài)學(xué)變化

如圖1可見，正常對照組(0 d組)小鼠皮膚均光滑，無鱗屑、皺褶、紅斑等。涂藥2 d后，BALB/c小鼠背部即開始出現(xiàn)細(xì)小鱗屑和點(diǎn)狀紅斑。第3天開始出現(xiàn)少量皺褶。涂藥4 d后，背部皮膚明顯增厚，鱗屑變?yōu)樾K狀、紅斑連成片狀，皺褶呈條狀隆起。涂藥6 d后，鱗屑開始部分脫落，脫落部位可見點(diǎn)狀出血。與BALB/c小鼠比較，C57BL/6小鼠于涂藥3 d后才出現(xiàn)少量鱗屑及點(diǎn)狀紅斑，之后癥狀緩慢加重。同一時間段比較，C57BL/6小鼠鱗屑、皺褶、紅斑、皮膚增厚等癥狀均較輕，至涂藥第6天鱗屑未見脫落。見圖1。

2.2 各組背部皮損PAIS評分變化

按PAIS評分標(biāo)準(zhǔn)繪制病變積分趨勢線，隨涂藥天數(shù)增加，病變積分逐漸增高，與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果一致，且同一時間段BALB/c小鼠的積分均高于C57BL/6小鼠，差異有顯著性(P< 0.05或P< 0.01)。見圖2。

2.3 背部皮損病理組織學(xué)變化

HE染色結(jié)果可見，正常組皮膚較薄，表面有少量角化，無充血、出血及炎癥細(xì)胞浸潤。涂藥2 d后表皮開始出現(xiàn)增厚，皮膚表面出現(xiàn)痂皮及少量角化。真皮可見輕度充血及少量炎細(xì)胞浸潤，以中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞浸潤為主。與同時間段C57BL/6小鼠比較，BALB/c小鼠皮膚增厚及角化不全較重。涂藥4 d后，BALB/c小鼠鱗狀上皮和表皮增厚、角化不全、炎癥浸潤等情況均較C57BL/6小鼠嚴(yán)重。涂藥6 d后，BALB/c小鼠被覆厚層鱗狀上皮，表皮進(jìn)一步增厚，角化不全嚴(yán)重，真皮層有輕度充血、出血，炎癥細(xì)胞浸潤增多。與BALB/c小鼠比較，C57BL/6小鼠表皮增厚、角化不全等病變程度明顯較輕。通過表皮厚度測量可見，2 d組、4 d組和6 d組BALB/c小鼠表皮厚度均大于同時間段C57BL/6小鼠，差異均有顯著性(P< 0.05或P< 0.01)。見圖3。

圖1 不同品系小鼠背部皮膚形態(tài)學(xué)變化Figure 1 Morphological changes of mouse back skin in different strains

注：同一時間點(diǎn)，BALB/c小鼠與C57BL/6小鼠比較，*P< 0.05，**P< 0.01。圖2 小鼠背部皮損PASI評分變化趨勢圖Note. BALB/c mice compared with C57BL/6 mice at the same time,* P< 0.05,**P< 0.01.Figure 2 The PASI scores of skin lesions in the mouse

注：A：涂藥局部皮膚病理組織學(xué)變化(HE染色，× 100)；B：表皮厚度變化。同一時間點(diǎn)，BALB/c小鼠與C57BL/6小鼠比較，* P< 0.05，**P< 0.01。圖3 各組小鼠皮損病理組織學(xué)的變化Note. A: Histopathological changes of the local skin after drug was applied. HE staining (× 100). B: Changes of epidermal thickness. BALB/c mice compared with C57BL/6 mice at the same time,* P< 0.05,**P< 0.01.Figure 3 The histological changes of mouse skin lesions

注：與BALB/c小鼠0 d組比較，* P< 0.05，**P< 0.01；與C57BL/6小鼠0 d組比較，# P< 0.05，## P< 0.01。圖4 不同品系小鼠皮損組織IL-23、IL-17A、IL-17F mRNA的相對表達(dá)量Note. Compared with BALB/c mice of the 0 d group,* P< 0.05,**P< 0.01. Compared with C57BL/6 mice of the 0 d group,# P< 0.05,## P< 0.01.Figure 4 The relative expression of IL-23, IL-17A, and IL-17F mRNA in skin lesions of different strains of mice

2.4 IL-23/IL-17軸相關(guān)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)

BALB/c和C57BL/6小鼠在造模后，其IL-23、IL-17A、IL-17F的mRNA相對表達(dá)量均呈拋物線樣變化。與0 d組比較，兩種小鼠在造模2，4，6 d后，IL-23、IL-17A、IL-17F均有明顯升高(P< 0.05或P< 0.01)。其中，BALB/c小鼠IL-23、IL-17A、IL-17F的mRNA表達(dá)水平在用藥2 d后即達(dá)到峰值，之后逐漸降低。C57BL/6小鼠IL-23、IL-17A、IL-17F的mRNA表達(dá)水平在用藥4 d后達(dá)到峰值，之后逐漸降低。見圖4。

3 討論

銀屑病是目前最常見的自身免疫性疾病之一，發(fā)病率高達(dá)2%左右[7-8]。其病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，且尚無有效的治愈方法[9]。銀屑病的臨床特點(diǎn)主要為反復(fù)發(fā)作的皮膚過度角化、鱗屑、紅斑形成，并伴有炎細(xì)胞浸潤、新生血管形成、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子的分泌。銀屑病的動物模型有多種，如藥物誘導(dǎo)型模型、陰道上皮模型、基因突變及轉(zhuǎn)基因模型等[10-12]。咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠模型，因其制作方法簡單、致病機(jī)制與人類銀屑病類似等原因，近年來被廣泛用于人類銀屑病研究[3, 13-14]。據(jù)文獻(xiàn)報道及本實驗室以往的研究經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)，該方法誘導(dǎo)的模型，一般于造模第6天銀屑病樣癥狀達(dá)高峰，之后癥狀逐漸減弱直至完全緩解，因此模型觀察期一般以6 d為宜[3, 15-16]。

本研究顯示，通過背部連續(xù)6 d涂抹62.5 mg的5%咪喹莫特乳膏(明欣利迪)后，可誘導(dǎo)BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠逐漸出現(xiàn)鱗屑、紅斑、皮膚增厚及皺褶等典型銀屑病樣皮損，病理組織學(xué)鱗狀上皮與表皮增厚、角化不全、角化過度、真皮充血、出血、炎癥細(xì)胞浸潤等改變均類似人類銀屑病表現(xiàn)。但同時間段兩種模型動物比較，BALB/c小鼠銀屑病樣癥狀出現(xiàn)更早、進(jìn)展更迅速，且癥狀更嚴(yán)重，銀屑病樣皮損更典型。于涂藥2～3 d后，BALB/c小鼠即開始出現(xiàn)細(xì)小鱗屑、紅斑等癥狀，4 d后鱗屑、皮膚增厚、紅斑等癥狀逐漸加重，到第6天達(dá)高峰。PAIS評分各項指標(biāo)比較，BALB/c小鼠也均高于C57BL/6小鼠。HE染色發(fā)現(xiàn)，隨著涂藥天數(shù)的增加，兩種動物模型表皮增厚、皮膚表面痂皮、角化不全、真皮充血、出血、炎癥細(xì)胞浸潤等表現(xiàn)均逐漸加重。但與形態(tài)學(xué)改變一致，BALB/c小鼠的各項病理指標(biāo)變化均更顯著且典型。

相關(guān)文獻(xiàn)報道，咪喹莫特作為Toll樣受體(TLR-7/8)激動劑，其誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮損的機(jī)制與IL-23/IL-17軸的激活有關(guān)[3, 17]。本研究同時測定了IL-23/IL-17軸相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BALB/c小鼠的IL-23、IL-17A和IL-17F等細(xì)胞因子的表達(dá)在涂藥2 d后即達(dá)高峰，之后逐漸回落，而C57BL/6小鼠在涂藥4 d后各項細(xì)胞因子才達(dá)高峰，之后逐漸回落，該結(jié)果與van der Fits等人[3]的結(jié)果趨勢一致，提示在咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病模型中，IL-23/IL-17軸的激活要先于銀屑病樣皮損的出現(xiàn)，也進(jìn)一步揭示IL-23/IL-17軸的激活是皮損出現(xiàn)的誘導(dǎo)因素。同時BALB/c小鼠IL-23/IL-17軸的激活要先于C57BL/6小鼠，提示IL-23/IL-17軸的優(yōu)先激活是BALB/c小鼠模型進(jìn)展更加迅速的主要原因之一。

綜上可見，咪喹莫特可誘導(dǎo)BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠皮膚均出現(xiàn)銀屑病樣皮損表現(xiàn)，其中BALB/c小鼠癥狀出現(xiàn)更早，進(jìn)展更迅速，鱗屑、皮膚增厚、角化過度及不全、炎癥細(xì)胞浸潤等皮損改變更典型。鑒于該模型病程短，且具有自限性等特點(diǎn)，BALB/c小鼠可能更適合用于人類銀屑病研究。此外，本研究表明IL-23/IL-17軸的激活可能是誘發(fā)小鼠銀屑病樣皮損的關(guān)鍵因素之一。