多壁碳納米管分散固相萃取凈化在測(cè)定水產(chǎn)品中3 種微囊藻毒素的應(yīng)用及與固相萃取法的比較

徐瀟穎，劉 柱，梁晶晶，陳萬(wàn)勤，周 霞，羅金文*

（浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 杭州 310052）

水體出現(xiàn)富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象時(shí)，藻類(lèi)會(huì)大量繁殖，不僅可使水生生物死亡，其產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物（如藻毒素），也會(huì)通過(guò)飲用水和水產(chǎn)品危害人類(lèi)健康[1-4]。在水華藻類(lèi)中，毒性最強(qiáng)、范圍最廣的是藍(lán)藻，其廣泛分布于江河、湖沼、海洋等水體中，在代謝過(guò)程中產(chǎn)生各種毒素，其中微囊藻毒素（microcystins，MCs）是危害最為嚴(yán)重的一類(lèi)，具有強(qiáng)烈致癌作用[5-8]。MCs是一類(lèi)有單環(huán)七肽的天然毒素，其主要結(jié)構(gòu)為環(huán)D-丙氨酸-R1-R2-赤-β-甲基-D-異天冬氨酸-L-Z-adda-D-異谷氨酸-N-甲基脫氫丙氨酸，通過(guò)兩個(gè)可變的L-氨基酸（R1和R2）的更替及其構(gòu)成氨基酸的去甲基化從而衍生出眾多的毒素類(lèi)型，至今為止，發(fā)現(xiàn)的異構(gòu)體已超過(guò)了100 種[9-13]。肝毒性是MCs的主要毒性，MCs進(jìn)入體內(nèi)后，專(zhuān)一性地與肝細(xì)胞內(nèi)的蛋白磷酸酶結(jié)合，當(dāng)攝入的藻類(lèi)毒素濃度低時(shí)，具有潛在的肝毒性和癌誘發(fā)活性，當(dāng)攝入濃度高時(shí)，則會(huì)引起急性中毒，嚴(yán)重者導(dǎo)致肝細(xì)胞腫脹、壞死、甚至死亡。MCs構(gòu)型中所含有的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和間隔雙鍵，使其能穩(wěn)定存在于水體及藍(lán)藻中。若水體受到MCs的污染，一方面會(huì)對(duì)飲用受到污染水的人群造成威脅；另一方面，MCs會(huì)在以浮游植物為食的淡水水產(chǎn)品（魚(yú)、蝦以及貝類(lèi)等）體內(nèi)進(jìn)行富集[14-17]，食用受到污染的水產(chǎn)品亦對(duì)人類(lèi)健康存在潛在威脅[18]。

近年來(lái)，水體富營(yíng)養(yǎng)化導(dǎo)致的藻類(lèi)毒素安全問(wèn)題日益受到重視，所以飲用水中MCs的測(cè)定方法也日趨多樣化，除了傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法、蛋白磷酸酶抑制等生化分析法，還有液相色譜法[18-20]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21-23]以及高分辨色譜分析法[24]等色譜分析方法。而水產(chǎn)品相比飲用水基質(zhì)更復(fù)雜，所以需采用適當(dāng)?shù)那疤幚斫档突|(zhì)對(duì)分析過(guò)程中的干擾，不少學(xué)者[25-26]采用HLB進(jìn)行凈化，但凈化過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)且成本較高；也有采用加速溶劑萃取法[27]，對(duì)水產(chǎn)品中的藻類(lèi)毒素進(jìn)行提取。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，活性炭可以吸附藻類(lèi)毒素，由于需要大量活性炭才能達(dá)到有效的吸附，而過(guò)量活性炭的使用對(duì)環(huán)境會(huì)造成不可避免的污染[28-29]。因此，本研究創(chuàng)新使用了碳納米管作為吸附劑，利用其化學(xué)穩(wěn)定性高、比表面積大、吸附容量大、成本低等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)水產(chǎn)品中的MCs進(jìn)行富集，再結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行定量分析。通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件以達(dá)到較好的回收率，建立水產(chǎn)品中痕量MCs的高選擇性和高靈敏度的精確分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱸魚(yú)、鰱魚(yú)、鳙魚(yú)、河蚌、河蝦等實(shí)驗(yàn)所用水產(chǎn)品購(gòu)買(mǎi)于浙江杭州當(dāng)?shù)厮a(chǎn)品市場(chǎng)。

多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）（純度＞97%，直徑20～40 nm，長(zhǎng)度＞5 μm）深圳市納米港科技有限公司；磁性多壁碳納米管（magnetic multi-walled carbon nanotubes，mMWCNTs）制備過(guò)程為利用濃硝酸羧化后磁化[30]；羧基化碳納米管（carbon nanotubes-COOH，CNTs-COOH）、氨基化碳納米管（carbon nanotubes-NH2，CNTs-NH2） 中科時(shí)代納米中心；Oasis HLB固相萃取小柱（200 mg/6 mL）美國(guó)Waters公司。

MCs標(biāo)準(zhǔn)品MC-YR（CAS：101064-48-6，（10±0.54）μg/mL）、MC-RR（CAS：111755-37-4，（10±0.50）μg/mL）、MC-LR（CAS：101043-37-2，（10±0.52）μg/mL） 香港Bepure公司；甲醇、乙腈（均為色譜級(jí)） 德國(guó)Merck公司；甲酸銨、乙酸銨（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸（質(zhì)譜級(jí)） 美國(guó)Sigma Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XR 30A液相色譜儀 日本Shimadzu公司；三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源） 美國(guó)AB SCIEX公司；Milli-Q超純水器 美國(guó)Millipore公司；氮?dú)獯蹈蓛x 瑞典Biotage公司；渦旋混合器 上海琪特公司；酸度計(jì) 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters Cortecs C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相：流動(dòng)相為甲醇（A）和5 mmol/L乙酸銨溶液（B），梯度洗脫程序：0～2 min，25% A；2～4 min，25%～80% A；4～6 min，80% A；6～9 min，80%～25% A。流速0.35 mL/min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子掃描，電離電壓5 500 V，離子源溫度500 ℃，氣簾氣流速30 L/min，碰撞氣流量50 L/min，化合物定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、去簇電壓、碰撞能量見(jiàn)表1。

表1 多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下MCs的質(zhì)譜條件Table 1 MS parameters for the analysis of microcystins under MRM mode

1.3.3 前處理

1.3.3.1 提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g淡水產(chǎn)品的食用部分于50 mL離心管中，加入8 mL 80%甲醇溶液，均質(zhì)器上以8 000 r/min混合1 min，然后超聲提取5 min，以15 000 r/min離心5 min后，取上清液，重復(fù)提取1 次，合并上清液于20 mL容量瓶中，用80%甲醇溶液定容至刻度。

1.3.3.2 固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）法凈化

準(zhǔn)確移取4.0 mL定容后的上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，用水稀釋至40 mL，待SPE凈化。HLB固相萃取小柱在使用前依次用甲醇和水各5 mL以1～2 mL/min流速淋洗活化后，將40 mL稀釋液轉(zhuǎn)移至HLB小柱上，控制流速1～2 mL/min；用5 mL 10%甲醇溶液溶液淋洗抽干后，用5 mL 0.1%甲酸-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，于35 ℃氮吹至近干，最后用20%甲醇溶液定容至2.0 mL，過(guò)0.22 μm濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3.3.3 分散固相萃取（dispersive solid phase extraction，DSPE）法凈化

取上述提取液2.0 mL于50 mL離心管中用水稀釋至20 mL后，加入40 mg碳納米管后，渦旋振蕩10 min，使含有MCs的樣品與吸附劑充分接觸混合后，5 000 r/min離心5 min（mMWCNTs可采用磁鐵置于樣品底部吸附），使吸附劑聚集于離心管底部，除去上清液。隨后加入體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-乙腈洗脫液1.0 mL，超聲混合10 min，5 000 r/min離心5 min后，過(guò)0.22 μm濾膜，進(jìn)行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 DSPE的條件優(yōu)化結(jié)果

在室溫條件下，向含有3 種MCs的空白鱸魚(yú)基質(zhì)溶液中分別加入CNTs-COOH、CNTs-NH2、MWCNTs以及自制mMWCNTs，對(duì)萃取條件進(jìn)行優(yōu)化。以3 種MCs的回收率為衡量指標(biāo)選擇最優(yōu)的萃取條件，對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中涉及的吸附劑用量、洗脫溶劑以及溶液pH值進(jìn)行考察。

2.1.1 碳納米管種類(lèi)對(duì)回收率的影響

以不含目標(biāo)物的鱸魚(yú)為空白基質(zhì)，分別采用4 種碳納米管作為分散固相萃取吸附劑，對(duì)10 μg/kg加標(biāo)水平下3 種MCs的回收率進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，CNTs-COOH以及mMWCNTs對(duì)3 種MCs都有較好的吸附效果，回收率在90.2%～96.2%之間，而CNTs-NH2以及MWCNTs的回收率遠(yuǎn)低于前兩者。主要是由于CNTs-COOH、mMWCNTs在基團(tuán)功能化中都帶有羧基，而羧基在凈化過(guò)程中的酸性（洗脫）條件下帶正電荷，對(duì)帶有兩個(gè)可變氨基酸的MCs可以有效的吸附，而CNTs-NH2、MWCNTs在酸性條件下對(duì)MCs都存在部分吸附作用，致使回收率偏低，因此考慮mMWCNTs作為DSPE的吸附劑。

圖1 不同碳納米管對(duì)3 種MCs回收率的影響Fig. 1 Recoveries of 3 MCs by using different CNTs

2.1.2 mMWCNTs添加量對(duì)回收率的影響

分別稱(chēng)取5、10、20、50、100 mg mMWCNTs吸附劑，加入20 mL含有3 種MCs（質(zhì)量濃度均為10 μg/L）的混合對(duì)照品基質(zhì)溶液中，使mMWCNTs與含目標(biāo)物的溶液充分混合后，在相同的條件下進(jìn)行洗脫，比較不同質(zhì)量吸附劑對(duì)MCs的回收率，結(jié)果見(jiàn)圖2。在5～20 mg范圍內(nèi)，隨吸附劑添加量的增大，3 種MCs的回收率都呈增加趨勢(shì)，20～50 mg時(shí)增加趨勢(shì)變緩慢，大于50 mg后，目標(biāo)物的回收率不再隨吸附劑的增加而增大。因此，選擇40 mg作為mMWCNTs的添加量。

圖2 mMWCNTs添加量對(duì)MCs吸附的影響Fig. 2 Effect of mMWCNTs addition on microcystins adsorption

2.1.3 不同洗脫劑對(duì)回收率的影響

圖3 不同洗脫劑對(duì)MCs洗脫的影響Fig. 3 Effects of different eluents on microcystins recovery

分別對(duì)甲醇、乙腈、0.1%甲酸-甲醇溶液、0.1%甲酸-乙腈溶液4 種洗脫劑的洗脫效果進(jìn)行考察，由圖3可知，乙腈較甲醇的洗脫效果更優(yōu)，在洗脫溶劑中加入0.1%甲酸與不加甲酸進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)相同溶劑中，加入甲酸的洗脫回收率較高，其中采用0.1%甲酸-乙腈溶液洗脫mMWCNTs吸附的MCs回收率在92.3%～95.5%之間，主要是由于MCs分子存在兩個(gè)自由的、可離子化的羧基和一個(gè)自由的氨基，這決定了生物分子MC-LR、MC-YR、MC-RR的帶電情況。因此酸性洗脫液促進(jìn)了多肽羧酸基團(tuán)的質(zhì)子化，使目標(biāo)物更容易被洗脫，所以選擇0.1%甲酸-乙腈溶液為最終洗脫劑。

2.2 不同凈化方式下MCs的方法學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液使用鱸魚(yú)空白基質(zhì)制備溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋?zhuān)玫?～50 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)物的峰面積Y為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，各化合物的線性范圍如表2所示，在1～50 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)均在0.99以上。

采用外標(biāo)法定量，在鱸魚(yú)的空白基質(zhì)中添加不同濃度的待測(cè)物，應(yīng)用1.3.3節(jié)的前處理方法，以信噪比為3確定各目標(biāo)化合物在不同方法中的檢出限，信噪比為10確定各目標(biāo)化合物的定量限，結(jié)果見(jiàn)表2。3 種MCs在不同凈化方式得到檢出限分別為0.1、0.2 μg/kg，可以達(dá)到對(duì)水產(chǎn)品中痕量藻毒素檢測(cè)的靈敏度。

表2 不同凈化方式下3 種MCs的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear regression equations, correlation coefficients and detection limits for 3 MCs

表3 不同凈化方式下MCs的回收率與RSD（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of microcystins from spiked fish sample using different clean-up methods (n= 6)

以未檢出3 種藻類(lèi)毒素的鱸魚(yú)為空白樣品進(jìn)行3 個(gè)不同含量（0.5、2、10 μg/kg）的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，按1.3.3節(jié)中所述前處理方法，每個(gè)含量設(shè)定6 個(gè)平行，分別對(duì)2 種不同的凈化方式進(jìn)行考察，結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，采用HLB獲得的回收率為90.8%～96.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.2%～3.0%，相比于DSPE，該方法更為穩(wěn)定，且回收率較高，但成本較高、凈化步驟繁瑣、操作過(guò)程費(fèi)時(shí)。DSPE回收率為88.7%～95.5%，略低于SPE法，但可以有效地將采用SPE法時(shí)每個(gè)樣品成本降低至10%以?xún)?nèi)，并將縮短凈化時(shí)間至原來(lái)的1/2。

2.3 不同基質(zhì)中MCs的回收率與精密度

采用不同的凈化方式在不同基質(zhì)的空白水產(chǎn)品中進(jìn)行2 μg/kg的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示，采用不同凈化方法時(shí)，HLB固相萃取柱獲得的回收率在89.6%～96.3%之間，且RSD均不大于2.8%，而采用DSPE獲得的回收率較低，RSD大。在不同基質(zhì)中，以魚(yú)為基質(zhì)獲得的加標(biāo)回收率要略高于另2 種基質(zhì)，主要是由于貝類(lèi)和蝦中的蛋白含量較高，含水量較低，當(dāng)加入80%甲醇溶液進(jìn)行提取時(shí)，基質(zhì)中蛋白變性，進(jìn)而導(dǎo)致提取回收率下降。

表4 不同基質(zhì)中MCs的回收率與RSD（n=6）Table 4 Recoveries and RSDs of microcystins in different matrixes spiked at 2 μg/kg (n= 6)

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果

在2017年7月浙江省杭州地區(qū)附近水域采集60 個(gè)水產(chǎn)樣品，包括鰱魚(yú)、鳙魚(yú)、河蚌、河蝦等常見(jiàn)的水產(chǎn)品。去除不可食用部分，勻漿后進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，確有少數(shù)水產(chǎn)品中存在藻毒素，其中MC-LR檢出量在0.28～0.77 μg/kg之間，檢出率為10%，而MC-RR的檢出值為0.32～0.58 μg/kg，檢出率為6.7%，MC-YR未見(jiàn)檢出，有檢出的樣品主要為魚(yú)類(lèi)和河蝦。對(duì)有檢出樣品進(jìn)行兩種凈化方式比較，結(jié)果差異不顯著，說(shuō)明DSPE凈化也可對(duì)水產(chǎn)品中的MCs進(jìn)行測(cè)定。

3 結(jié) 論

對(duì)4 種不同性質(zhì)的碳納米吸附劑進(jìn)行考察，并通過(guò)單一變量法對(duì)碳納米吸附劑的添加量以及不同洗脫溶劑的考察，最終確立了以40 mg的mMWCNTs為分散固相萃取吸附劑對(duì)含有MCs的提取溶液進(jìn)行吸附后，利用0.1%甲酸-乙腈溶液進(jìn)行洗脫，能獲得較好的回收，回收率在88.7%～95.5%之間，RSD均小于4.2%，而HLB回收率為89.6%～96.7%，但其節(jié)約時(shí)間以及耗材成本低，檢出限能夠滿(mǎn)足我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)控制要求，且在對(duì)不同基質(zhì)的回收率及精密度考察中，具有較好的適用性，回收率水平均在88.1%以上，為水產(chǎn)品中MCs的測(cè)定提供了新方法。