固相萃取柱凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定液態(tài)乳中14 種真菌毒素

孫曉冬，郝 杰，毛 婷，邵瑞婷，姜 潔*

（北京市食品安全監(jiān)控和風險評估中心，北京 100094）

真菌毒素是某些真菌在特定條件下產(chǎn)生的具有毒性的次級代謝產(chǎn)物，可廣泛污染農(nóng)作物及其副產(chǎn)品[1-3]，并會引起動物或人類急性或慢性中毒[4-5]，部分真菌毒素還具有致畸、致癌、致突變作用[6-7]，對健康造成極大的威脅。目前已知能產(chǎn)生真菌毒素的真菌有150多種，產(chǎn)生的真菌毒素有300多種，按其主要菌種[8-9]可以分為曲霉菌毒素，如黃曲霉毒素和棕曲霉毒素等；鐮刀菌毒素，如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、T-2毒素等；以及青霉菌毒素。而液態(tài)乳中殘留的真菌毒素主要有不同種類的鐮刀菌毒素和黃曲霉毒素[10-12]。

近年來，隨著對真菌毒素認識的提高以及對其廣泛的關(guān)注，真菌毒素的檢測分析技術(shù)得到了長足的發(fā)展和進步。目前對多種真菌毒素同時檢測的凈化方法主要有免疫親和色譜法[13]、凝膠滲透色譜法[14-15]、QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, safe）法[16-17]等，免疫親和色譜法有較強的選擇性但價格較高，凝膠滲透色譜時間長且難以鑒別分離組分，QuEChERS凈化效果有限且稀釋倍數(shù)較大，凈化后低濃度的待測分析物可能無法滿足檢測要求[18-19]。Oasis PRiME HLB是一種新型固相萃取柱[20-24]，國內(nèi)外文獻中使用該固相萃取柱作為凈化手段的檢測方法有很多，但鮮少應用在液態(tài)乳中真菌毒素的檢測。Oasis PRiME HLB的吸附劑是由親脂性二乙烯苯與親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成大孔共聚物，親水親酯，有獨特的水浸潤平衡特性，能有效吸附乳制品中富含的磷脂等基質(zhì)干擾物而對待測物無吸附，降低基質(zhì)效應，且無需進行吸附劑的活化和平衡步驟，無需淋洗，及后續(xù)氮吹復溶，操作簡單，節(jié)省時間和有機溶劑的消耗，方法穩(wěn)定可靠。本實驗采用Oasis PRiME HLB固相萃取柱進行樣品凈化，快速準確篩查液態(tài)乳中多種真菌毒素。其具有前處理簡單、分析時間短、靈敏度較高以及定性定量可靠的優(yōu)勢，滿足了液態(tài)乳中安全風險突發(fā)事件的快速應急處理工作中高通量、高可靠性確證和定量分析的要求，能夠為企業(yè)及相關(guān)安全監(jiān)管部門提供有利的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

液態(tài)乳從北京市各大市場、超市隨機抽取。

黃曲霉毒素B1（純度98.0%，CAS號：1162-65-8）、黃曲霉毒素B2（純度98.0%，CAS號：7220-81-7）、黃曲霉毒素G1（純度98.0%，CAS號：1165-39-5）、黃曲霉毒素G2（純度98.0%，CAS號：7241-98-7）、黃曲霉毒素M1（純度98.0%，CAS號：6795-23-9）、赭曲霉毒素A（純度98.0%，CAS號：303-47-9）、玉米赤霉烯酮（純度99.0%，CAS號：17924-92-4） 美國O2si公司；橘霉素（純度97.0%，CAS號：518-75-2） 加拿大TRC公司；T-2毒素（純度99.0%，CAS號：21259-20-1）、伏馬毒素B1（純度99.0%，CAS號：116355-83-0）、伏馬毒素B2（純度99.0%，CAS號：116355-84-1）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（純度99.9%，CAS號：51481-10-8）ROMER國際貿(mào)易有限公司；青霉酸（純度99.0%，CAS號：90-65-3） 百靈威科技有限公司；雜色曲霉素（純度99.0%，CAS號：10048-13-2） 美國Sigma公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 美國Thermo Fisher公司；甲酸（色譜純） 德國CNW Technology GmbH公司；Oasis PRiME HLB固相萃取柱（6 mL/200 mg）美國Waters公司。實驗用水為Milli-Q制備的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity UPLC I-class超高效液相色譜系統(tǒng)、Xevo TQ-S三重四極桿質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源及Masslynx 4.1 SCN803軟件系統(tǒng)） 美國Waters公司；Milli-Q純水儀美國Millipore公司；3K18高速冷凍離心機 美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

各標準品于10 mL棕色容量瓶中用甲醇溶解，并定容到刻度，配制成1 000 μg/mL的標準儲備液，轉(zhuǎn)入棕色樣品瓶中于-20 ℃保存，有效期3 個月。

1.3.2 樣品前處理

稱取5.00 g樣品于離心管中，加入10 mL 0.1%酸化乙腈，渦旋振蕩3 min至充分混勻，超聲5 min后，于4 ℃、10 000 r/min離心5 min，取上清液2 mL過PRiME HLB固相萃取柱，1 mL乙腈淋洗，收集全部流出液，40 ℃氮氣吹至近干，0.1%甲酸溶液-甲醇（1∶1，V/V）1 mL復溶，過0.22 μm濾膜，待儀器分析。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸溶液；梯度洗脫條件：0～2.00 min 5%～25% A，2.00～6.00 min 25%～60% A，6.00～7.00 min 60%～95% A，7.00～8.00 min 95% A，8.00～9.00 min 95%～5% A，9.00～12.00 min 5% A；進樣量10 μL，進樣溫度10 ℃。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；多反應監(jiān)測模式（multiple-reaction monitoring，MRM）正離子模式；毛細管電壓2.00 kV；離子源溫度150 ℃；錐孔氣流量150 L/h；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流量650 L/h。14 種真菌毒素的色譜及質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 14 種真菌毒素的色譜及質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 Chromatographic and spectral acquisition parameters for the determination of 14 mycotoxins

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜-質(zhì)譜分析

2.1.1 流動相的選擇

考察采用甲醇或乙腈為流動相A，水或0.1%甲酸溶液或5 mmol/L乙酸銨為流動相B對14 種真菌毒素測定的影響。結(jié)果表明：選擇流動相為乙腈和0.1%甲酸溶液能明顯提高目標峰的信號強度，化合物的峰形得到了很好的改善，其中不同的流動相B對化合物的色譜峰優(yōu)化效果比較明顯，因為14 種真菌毒素在電噴霧離子源正離子模式生成加氫離子，當流動相中加入0.1%甲酸時，化合物基團結(jié)合質(zhì)子帶正電荷，在電噴霧離子源正離子模式下就很容易得到加氫離子，能有效提高離子化效率；加入0.1%甲酸還能調(diào)節(jié)溶液的pH值，以改善化合物的峰形，有效防止峰拖尾。圖1為不同流動相B條件下脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬毒素B2、青霉酸3 種化合物的色譜圖。

圖1 不同流動相的MRM色譜圖Fig. 1 MRM chromatograms with different mobile phases

2.1.2 色譜柱的選擇

考察Waters UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Waters UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）兩種常用類型的色譜柱對14 種真菌毒素測定的影響。結(jié)果表明：兩種色譜柱對14 種真菌毒素的分離效果沒有很大的優(yōu)勢區(qū)別，但Waters UPLC HSS T3色譜柱的色譜圖基線噪音較低，目標物色譜峰的信號強度較高，故實驗選擇Waters UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱作為分析柱。圖2為兩種色譜柱中14 種真菌毒素的提取總離子流圖。

圖2 14 種真菌毒素的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion current chromatograms of 14 mycotoxins on different columns

2.1.3 母離子和子離子的選擇

取100 ng/mL的各化合物標準溶液放在蠕動泵進樣器上，設(shè)定流動相速率為0.1 mL/min，蠕動泵流速20 μL/min，混合模式進樣，調(diào)節(jié)毛細管電壓、錐孔電壓、脫溶劑氣的溫度、脫溶劑氣的流速、錐孔氣流速等質(zhì)譜參數(shù)，盡可能得使目標物響應信號達到最高。

使用儀器軟件自動調(diào)諧功能為每個母離子自動篩選出最佳的錐孔電壓和碰撞電壓從而得到在該碎裂條件下的2 個子離子。對得到的子離子結(jié)合化合物的結(jié)構(gòu)式和碎裂規(guī)律[25-27]進行再次分析，以驗證儀器自動篩選的子離子功能的準確性。

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化

快速測定液態(tài)乳中14 種真菌毒素需要通用、快速、回收率效果好的前處理方法，本研究考察的前處理方法需要能有效凈化基質(zhì)中的干擾。取質(zhì)量濃度為50 ng/mL的真菌毒素混合標準溶液，以大梯度流動相比例條件下，使用Waters UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱分離，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進樣，根據(jù)色譜的分離原理，在反相液相色譜中，固定相是非極性或弱極性的，而流動相是極性的，因此極性強的組分易溶于流動相先出柱，極性弱的組分與固定相結(jié)合較緊密后出柱。按保留時間對14 種真菌毒素的極性大小進行排序，分別為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、青霉酸、黃曲霉毒素M1、黃曲霉毒素G2、橘霉素、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素B1、伏馬毒素B1、赭曲霉毒素A、伏馬毒素B2、T-2毒素、玉米赤霉烯酮、雜色曲霉素，再結(jié)合14 種化合物的化學結(jié)構(gòu)分析其鍵的極性和鍵在空間分布的對稱性驗證各化合物極性大小的準確性，最終結(jié)果一致。選取14 種真菌毒素中極性有較大差異的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、橘霉素、伏馬毒素B1、玉米赤霉烯酮4 種化合物作為依據(jù)，樣品在相同加標量10 μg/kg的情況下，分別考察乙腈、0.1%酸化乙腈、甲醇不同提取液的回收率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同提取溶劑的回收率Fig. 3 Comparison of mycotoxin recoveries with different extraction solvents

實驗過程中發(fā)現(xiàn)，乙腈和甲醇分別作為提取溶劑時，乙腈能有效沉淀液態(tài)乳中的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，同時前處理過程中還采取4℃冷凍高速離心，沉淀效果明顯，甲醇則無明顯沉淀現(xiàn)象，提取回收率較差，故不做考慮。如圖3所示，使用0.1%酸化乙腈作為提取溶液時，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、橘霉素、伏馬毒素B1、玉米赤霉烯酮均可以達到較好和較為穩(wěn)定的回收率。

2.2.2 凈化條件的優(yōu)化

樣品在使用相同提取試劑和相同加標量10 μg/kg的條件下，以總體回收率較差的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素、伏馬毒素B2、青霉酸4 種化合物作為依據(jù)，分別考察QuEChERS 5982-5650（4 g MgSO4，1 g NaCl，1 g檸檬酸鈉，0.5 g三水合二檸檬酸二鈉）、Oasis PRiME HLB固相萃取柱、C18固相萃取柱、MycoSep 227多功能凈化柱共4 種凈化條件的效果比較?；厥章式Y(jié)果和凈化效果對比如圖4和圖5所示。

圖4 回收率結(jié)果對比圖Fig. 4 Comparison of mycotoxin recoveries with different cleanup columns

圖5 不同凈化方式對磷脂凈化效果的比較Fig. 5 Comparison of different methods for the cleanup of phospholipids

凈化過程中發(fā)現(xiàn)，C18固相萃取柱和MycoSep 227多功能凈化柱操作復雜且流速較慢，回收率沒有明顯的優(yōu)勢，故不做考慮。QuEChERS是一種基質(zhì)分散固相萃取技術(shù)，利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附雜質(zhì)從而達到除雜凈化的目的，這種凈化模式和pass-through凈化很相似，但是基質(zhì)分散固相萃取是一階凈化（理論塔板數(shù)為1），而pass-through凈化是多階凈化，且QuEChERS方法的回收率低于Oasis PRiME HLB固相萃取柱；Oasis PRiME HLB吸附劑可以吸附樣品中非極性干擾物而不影響任務目標物的回收率，特別是對于液態(tài)乳中含有的卵磷脂、腦磷脂和神經(jīng)鞘磷脂等基質(zhì)干擾物[28-29]，去除效果明顯，降低基質(zhì)效應的影響，其特殊設(shè)計的篩板、填料以及制作工藝，使得溶液流速更順暢更快速，節(jié)省時間和溶液，從而達到用簡便的過濾式樣品制備流程實現(xiàn)潔凈樣品凈化的目的。如圖4和圖5所見，樣品使用Oasis PRiME HLB固相萃取柱凈化處理后，基質(zhì)干擾物少，回收率穩(wěn)定且高于其他3 種。

2.2.3 復溶溶液的選擇

當選擇流動相0.1%甲酸溶液-乙腈（1∶1，V/V）作為復溶溶液時，個別化合物的峰形差，靈敏度降低，而選擇0.1%甲酸溶液-甲醇（1∶1，V/V）作為復溶溶液時，化合物的峰形較好，靈敏度有所提高，能夠準確定性和定量，對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇這個化合物尤為明顯，因為甲醇是供質(zhì)子溶劑，促進了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇酚羥基鄰位上的甲氧基在溶液中的電離平衡向分子方向移動，使得溶液中分子狀態(tài)的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇增多，響應增強，靈敏度提高[30-31]，故選擇0.1%甲酸溶液-甲醇（1∶1，V/V）作為復溶溶液。圖6為不同復溶溶液的14 種真菌毒素色譜圖。

圖6 不同復溶溶液的14 種真菌毒素MRM色譜圖Fig. 6 MRM chromatograms of 14 mycotoxins dissolved in different solvents

綜上所述，使用0.1%酸化乙腈作為提取溶劑，Oasis PRiME HLB固相萃取柱作為凈化方法，0.1%甲酸溶液-甲醇（1∶1，V/V）作為復溶溶液可以達到14 種真菌毒素較好的前處理提取凈化效果，目標化合物的回收率均在80%以上。

2.3 方法學驗證

2.3.1 標準曲線的繪制

根據(jù)14 種真菌毒素響應的強弱，配制不同的系列質(zhì)量濃度的混合標準工作溶液，14 種化合物的線性范圍由0.5～100 ng/mL，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見表2。

表2 14 種真菌毒素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍Table 2 Liner equations, correlation coefficients and liner ranges for 14 mycotoxins

2.3.2 方法的靈敏度和精密度

根據(jù)GB/T 2761—2017《食品中真菌毒素限量》，液態(tài)乳中黃曲霉毒素M1的限量值為0.5 μg/kg，參考GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》附錄F檢測方法確認的技術(shù)要求中有關(guān)方法靈敏度、回收率和精密度的實驗要求。研究液態(tài)乳中14 種真菌毒素測定方法的定量限及回收率。取空白樣品，添加不同系列水平的混合標準溶液，繪制基質(zhì)加標工作曲線。在基質(zhì)中加入不同量的混合標準溶液，制成加標陽性樣品，進行前處理，將得到的樣品上機檢測，得到信噪比不低于10的目標化合物的最低加標濃度，即為本方法在基質(zhì)中的定量限。取空白基質(zhì)，3 個不同水平的加標量，其中黃曲霉毒素M1取定量限、最高殘留量及其他任意濃度水平點進行加標；其他未規(guī)定有最高殘留量的真菌毒素，取1、2、10 倍定量限進行加標。經(jīng)過前處理并上機檢測，每個水平做6 組平行實驗，計算回收率及相對標準偏差。方法定量限、回收率和相對標準偏差見表3。3 個添加水平時，平均回收率為67.7%～112.7%，相對標準偏差為0.43%～7.28%。

表3 14 種真菌毒素的方法定量限、回收率和相對標準偏差Table 3 LOQs, recoveries and RSDs of 14 mycotoxins

2.4 方法應用

應用本方法對隨機抽取的液態(tài)乳樣品進行了測定，共計50 個樣品，同時做11 個質(zhì)控樣品。在11 個質(zhì)控樣品中檢出了真菌毒素的殘留，其余樣品均未檢出，結(jié)果見表4。

表4 11 個質(zhì)控樣品中真菌毒素的殘留結(jié)果Table 4 Contents of mycotoxins in 11 quality control samples determined by the method developed in this study

3 結(jié) 論

本實驗利用固相萃取柱Oasis PRiME HLB的有效凈化手段，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究建立了液態(tài)乳中14 種真菌毒素的測定方法，該方法準確、快捷，并且進行了方法學驗證和實際樣品的應用，結(jié)果表明：14 種真菌毒素的定量限（RSN≥10）為0.5～5 μg/kg，高、中、低3 個添加水平條件下，平均回收率為67.7%～112.7%，相對標準偏差為0.43%～7.28%，實際樣品的測量相對誤差為0.0%～6.4%，可實現(xiàn)液態(tài)乳中14 種真菌毒素的同時定性和準確定量分析，適合用于液態(tài)乳中安全風險突發(fā)事件的快速應急處置工作，能夠為企業(yè)及相關(guān)安全監(jiān)管部門提供有利的技術(shù)支撐。