不同前處理方法對(duì)豬組織中喹諾酮類獸藥殘留檢測效果對(duì)比

王 杰，裴 斐，李 彭，白宇杰，方 勇，楊文建，馬 寧，胡秋輝*

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

喹諾酮類藥物又稱吡酮酸類或吡啶酮酸類，是人工合成的含4-喹諾酮基本結(jié)構(gòu)的抗菌藥。其主要以阻斷DNA回旋酶，進(jìn)一步造成細(xì)菌DNA的不可逆損害來達(dá)到抗菌效果[1-3]。目前應(yīng)用于臨床的喹諾酮類藥物主要有諾氟沙星（norfloxacin，NOR）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、氧氟沙星（ofloxacin，OFL）等，該類藥物對(duì)多種革蘭氏陰性菌有良好的殺菌作用，并且價(jià)格低廉、抗菌譜廣，被廣泛應(yīng)用于臨床及獸藥領(lǐng)域[4-7]。然而由于喹諾酮類藥物有致癌、致畸、致突變的特點(diǎn)，濫用引發(fā)的環(huán)境危害和人類疾病風(fēng)險(xiǎn)成為目前的焦點(diǎn)，美國和歐盟都對(duì)喹諾酮類藥物做出了相應(yīng)的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，我國農(nóng)業(yè)部也已禁用洛美沙星（lomefloxacin，LOM）、培氟沙星（pefloxacin，PEF）、OFL和NOR 4 種合成抗菌藥，并且規(guī)定動(dòng)物肌肉組織中恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）、達(dá)氟沙星、氟甲喹（flumequine，F(xiàn)LU）、沙拉沙星（sarafloxacin，SAR）、二氟沙星（difloxacin，DIF）、惡喹酸（oxolinic acid，OXO）的最高殘留限量在10～500 μg/kg[8-9]之間。因此，建立一種快速、便捷、高通量的方法對(duì)滿足日益增長的監(jiān)管需求具有重要意義。

動(dòng)物源性食品具有基質(zhì)復(fù)雜、干擾物質(zhì)多、不易分離提純等特點(diǎn)，因而前處理方法和質(zhì)譜技術(shù)是影響獸藥檢測的關(guān)鍵[10]。傳統(tǒng)的樣品前處理方法包括液液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）和固相萃?。╯olidphase extraction，SPE）等，近年來QuEChERS（quick,easy, cheap, effective, rugged, safe）法因其快速、便捷、有效等特點(diǎn)被由農(nóng)藥殘留檢測逐步應(yīng)用于獸藥殘留檢測領(lǐng)域[11-13]。然而QuEChERS方法還有許多方面需要改進(jìn)，目前QuEChERS方法主要應(yīng)用于低脂肪食品中，因此尋找適合于高脂肪的吸附劑對(duì)于獸殘檢測來說尤為重要。近期Agilent公司推出的增強(qiáng)型脂質(zhì)去除 （enhanced matrix removal-lipid，EMR-L）技術(shù)是建立在QuEChERS法基礎(chǔ)上的分散固相萃取鹽包，它集成了QuEChERS方法的優(yōu)點(diǎn)并采用了創(chuàng)新性的新型吸附劑，簡化了傳統(tǒng)操作步驟，對(duì)于獸藥殘留檢測市場具有很好的前景[14-17]。EMR-L萃取技術(shù)包含兩部分，EMR-L Polish管由1.6 g無水硫酸鎂和0.4 g氯化鈉組成，EMR-L d-SPE管中含有1.0 g特殊的吸附劑。Anumol等[18]對(duì)EMR-L與傳統(tǒng)分散固相萃取技術(shù)做了系統(tǒng)的比較，研究表明與傳統(tǒng)分散固相萃取技術(shù)相比，EMR-L在前處理后的基質(zhì)共提物和產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)方面有顯著優(yōu)勢，并且證明EMR-L由于其良好的凈化效果可以很好地契合高分辨質(zhì)譜滿足高通量篩查。另外，Waters公司的Oasis PRiME HLB固相萃取柱系列一直是備受業(yè)界青睞的前處理產(chǎn)品[19-22]，固相填料由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮聚合成，該方法操作便捷，只需經(jīng)過簡單前處理一步過柱，無需活化與平衡就能上機(jī)測樣。Li Xiaowei等[21]運(yùn)用Oasis PRiME HLB方法結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測豬糞中82 種獸藥殘留，97%獸藥的定量限低于5 μg/kg，平均回收率在60%～110%之間。質(zhì)譜法發(fā)展至今已經(jīng)成為農(nóng)獸殘檢測的重要手段，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）基于其強(qiáng)大的定量和痕量檢測能力可以同時(shí)檢測識(shí)別數(shù)百種目標(biāo)化合物，在獸藥分析領(lǐng)域占據(jù)主導(dǎo)地位。高分辨質(zhì)譜如四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（quadrupole-time-of-flight tandem mass spectrometry，Q-TOF/MS）作為一種廣譜化的檢測技術(shù)，其全掃描模式可提供碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)，優(yōu)良的定性能力可以大大減少假陽性結(jié)果的產(chǎn)生[23-24]。

從目前文獻(xiàn)來看，前處理方法種類繁多，應(yīng)用于不同的質(zhì)譜技術(shù)上有不同的結(jié)果，缺少對(duì)市售商業(yè)去脂產(chǎn)品的系統(tǒng)比較，不能很好地整合人力成本和時(shí)間成本。我國是豬養(yǎng)殖與消費(fèi)大國，豬組織消耗量占世界總產(chǎn)量一半以上，因此開發(fā)建立豬組織中喹諾酮便捷可靠檢測方法是保障豬組織質(zhì)量安全的重要基礎(chǔ)?；诖耍狙芯窟x用Oasis PRiME HLB固相萃取柱以及EMR-L萃取鹽包，以傳統(tǒng)的乙腈一步提取、正己烷去脂的LLE法作為對(duì)照，結(jié)合不同的質(zhì)譜平臺(tái)系統(tǒng)綜合地研究比較三者的差異，旨在探索“豬肉基質(zhì)-前處理手段-質(zhì)譜檢測類型”之間的適用匹配關(guān)系，為拓展獸殘檢測方法、提升檢測技術(shù)水平、保障食品安全，提供技術(shù)參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬肉、豬肝、豬腎，購自南京仙林農(nóng)貿(mào)市場。

16 種喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）：CIP（CAS#：85721-33-1）、克林沙星（clinafloxacin，CLX，CAS#：105956-97-6）、ENR（CAS#：93106-60-6）、FLU（CAS#：42835-25-6）、LOM（CAS#：98079-51-7）、NOR（CAS#：70458-96-7）、OFL（CAS#：82419-36-1）、SAR（CAS#：98105-99-8）、OXO（CAS#：14698-29-4）、PEF（CAS#：70458-92-3）、依諾沙星（enoxacin，ENO，CAS#：74011-58-8）、萘啶酸（nalidixic acid，NDA，CAS#：389-08-2）、西諾沙星（cinoxacin，CIN，CAS#：28657-80-9）、DIF（CAS#：98106-17-3）、奧比沙星（orbifloxacin，ORB，CAS#：113617-63-3）、司帕沙星（sparfloxacin，SPA，CAS#：110871-86-8） 美國Sigma公司；乙腈、甲醇、甲酸、正己烷（均為色譜純）德國Merck公司。

16 種標(biāo)準(zhǔn)品分別稱取10 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的單元素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-20 ℃冰箱中貯存，保存期限為1 個(gè)月。根據(jù)需要將上述儲(chǔ)備液混合稀釋成不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 儀器與設(shè)備

Xevo TQ-S UPLC-MS聯(lián)用儀（包括Acquity UPLC系統(tǒng)、電噴霧離子源及MassLynx4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）、Oasis PRiME HLB固相萃取柱 美國Waters公司；Triple TOF 5600＋TOF/MS儀（配有電噴霧離子源及Analyst1.7數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國AB公司；Nexer系列UPLC儀（配有DGU-20A5R脫氣機(jī)、SIL-30AC自動(dòng)進(jìn)樣器、SPDM-20A紫外檢測器、CTO-30A柱溫箱及LC-30AD溶液輸送單元） 日本島津公司；Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）、EMR-Lipid QuEChERS萃取鹽包 美國Agilent公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；DL-5C離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；T18均質(zhì)機(jī) 德國IKA公司；XW-80A微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流速0.2 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。流動(dòng)相A：0.1 %甲酸溶液；流動(dòng)相B：0.1%甲酸-乙腈溶液。梯度洗脫程序：0～2.5 min，5%～55% B；2.5～5 min，55%～90% B；5～7 min，90%～5% B。UPLC-MS/MS與UPLC-Q-TOF/MS色譜條件相同。

1.3.2 MS條件

1.3.2.1 MS/MS條件

電噴霧離子源，正離子模式；脫溶劑溫度450 ℃；毛細(xì)管電壓2 300 V；脫溶劑氣流速850 L/min；錐孔反吹氣流速50 L/min；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）。質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 16 種喹諾酮類藥物的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 Parameters for UPLC-MS/MS analysis of the 16 quinolones

1.3.2.2 Q-TOF/MS條件

電噴霧離子源，正離子模式；離子源溫度550 ℃；電噴霧電壓5 500 V；霧化氣（GS1）流速55 μL/min；輔助加熱氣（GS2）流速55 μL/min；氣簾氣流速35 μL/min；去簇電壓80 V；碰撞電壓10 V；離子富集時(shí)間0.1 s；質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 000；采集模式：全離子掃描串聯(lián)信息依賴檢索（information dependent acquisition，IDA）。IDA模式下，去簇電壓80 V；碰撞電壓35 V；碰撞能量散布范圍15 V；離子富集時(shí)間0.05 s。

1.3.3 樣品前處理

1.3.3.1 提取

將豬肉、豬肝及豬腎分別攪拌均質(zhì)后稱取2 g（精確至0.1 g）于50 mL離心管中，加入10 mL含有0.1%甲酸的乙腈溶液，于旋渦混勻器上渦旋5 min后在40 ℃中超聲水浴10 min，以4 000 r/min離心5 min，取上清液備用。

1.3.3.2 凈化

EMR-L法：將5 mL超純水加入EMR-L dSPE管中，渦旋15 s使其充分活化。取5 mL上清液立即加入活化后的EMR-L dSPE管中，渦旋5 min，40 ℃超聲水浴10 min，以4 000 r/min離心5 min，收集5 mL上清液加入EMR-L Polish管中，重復(fù)上述渦旋、超聲及離心步驟，取上清液過0.22 μm濾膜待測。

Oasis PRiME HLB法：取5 mL上清液裝載至6 mL 200 mg規(guī)格Oasis PRiME HLB固相萃取柱中，無需活化和平衡，保持1 s一滴流速，收集流出液并過0.22 μm濾膜待測。

LLE法：將10 mL正己烷加入上清液中，渦旋振蕩5 min后靜置分層，去除上層正己烷層，重復(fù)去脂1 次，取下層清液過0.22 μm濾膜待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)提取物

圖1 豬組織中3 種方法處理后的基質(zhì)提取物Fig. 1 Extractives in porcine tissues with three sample preparation methods

基質(zhì)提取物的比較是評(píng)價(jià)高通量檢測方法可行性的重要標(biāo)準(zhǔn)[25]，通過EMR-L、Oasis PRiME HLB和LLE法分別凈化過的豬肉、豬肝和豬腎基質(zhì)，取1 mL烘干后的基質(zhì)提取物見圖1。由于喹諾酮類藥物大多含有哌嗪和喹啉結(jié)構(gòu)，呈弱堿性，因此在乙腈中加入少量甲酸可以有效促進(jìn)其離子化效率。由圖1可知，Oasis PRiME HLB方法的凈化效果明顯優(yōu)于以單一溶劑提取的LLE法，這是因?yàn)槠溆H脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮聚合成的固相填料可以很好地吸附脂質(zhì)[26]。EMR-L方法處理樣品中有少量鹽類物質(zhì)析出，這是由于EMR-L方法的鹽析步驟中含有大量NaCl和MgSO4。為了深入探索基質(zhì)提取物對(duì)分離測定的影響，本研究分別考察3 種方法提取凈化過后的樣品質(zhì)譜信號(hào)，重復(fù)進(jìn)樣100 次后，EMR-L與LLE法所處理樣品的信號(hào)強(qiáng)度及峰形均有不同程度的降低，基線噪音與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）顯著增高。研究證明大量的鹽類及脂質(zhì)會(huì)降低色譜分離和離子源電離效率，并會(huì)顯著影響儀器靈敏度[27]。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

表2 豬組織中喹諾酮類獸藥在UPLC-MS/MS檢測下的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effects for UPLC-MS/MS analysis of quinolones in porcine tissues using three sample preparation methods

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中被分析物之外的組分，與目標(biāo)分析物競爭電離所產(chǎn)生的影響。對(duì)于復(fù)雜樣品的質(zhì)譜分析中，特別是電噴霧離子源，如何減少基質(zhì)效應(yīng)是尤為關(guān)鍵的問題[28]，因此本研究采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線減少基質(zhì)效應(yīng)。制備基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線（加標(biāo)量1、5、10、20、50、100 μg/kg），根據(jù)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值減1評(píng)價(jià)不同方法處理不同基質(zhì)時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)在±20%時(shí)，表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯；當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)大于20%時(shí)，表明有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)小于-20%時(shí)，表明有基質(zhì)抑制效應(yīng)。從表2可以看出，絕大部分喹諾酮類獸藥在3 種基質(zhì)和3 種前處理方法中基質(zhì)效應(yīng)不明顯，僅有CIP和CIN在LLE法中出現(xiàn)了較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此，為了獲得更好的定量效果，本研究使用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線來抵消基質(zhì)效應(yīng)。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

將豬肉、豬肝、豬腎空白樣品，配制6 個(gè)梯度水平的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測定。以定量離子峰面積（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x，μg/L）為橫坐標(biāo)作定量工作曲線，得到豬組織中線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)r分別為0.991 4～0.999 9（EMR-L）、0.993 2～0.999 1（Oasis PRiME HLB）、0.990 2～1.000 0（LLE），表明經(jīng)過3 種方法處理過的16 種喹諾酮類藥物在1.0～100.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以3 倍信噪比計(jì)算得到檢出限分別為0.04～0.23（EMR-L）、0.08～0.41（Oasis PRiME HLB）、0.21～1.07 μg/kg（LLE），10 倍信噪比算得定量限分別為0.13～0.56（EMR-L）、0.27～1.36（Oasis PRiME HLB）、0.70～3.57 μg/kg（LLE）。

取空白樣品加入16 種喹諾酮類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成5、10、20 μg/kg 3 個(gè)水平的添加樣品各6 份，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，如表3所示。EMR-L平均回收率（RSD）分別為豬肉：71.7%～98.1%（0.5%～9.0%），豬肝：80.3%～106.7%（0.2%～16.8%），豬腎：75.0%～106.9%（0.8%～14.3%）；Oasis PRiME HLB平均回收率（RSD）分別為豬肉：76.1%～106.1%（0.2%～17.8%），豬肝：71.8%～118.3%（0.1%～15.6%），豬腎：70.7%～93.9%（1.3%～7.5%）；LLE平均回收率（RSD）分別為豬肉：52.3%～98.8%（0.5%～11.5%），豬肝：64.4%～99.6%（0.3%～9.7%），豬腎：60.4%～87.6%（0.7%～18.8%），LLE方法所測樣品中不在70%～120%之間的比例約為12.5%。由于豬肉、豬肝、豬腎樣品含水量、基質(zhì)組成成分差異等特點(diǎn)，與Oasis PRiME HLB相比EMR-L對(duì)含水量較高的豬肝、豬腎樣品有較好的重復(fù)性；而Oasis PRiME HLB基于其特殊的親脂平衡性，對(duì)于脂肪含量較高的豬肉有更好的脂質(zhì)吸附效果。

表3 豬組織中喹諾酮類獸藥在UPLC-MS/MS檢測下的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）Table 3 Recoveries and precision (RSDs) for quinolones spiked into porcine with three sample preparation methods by UPLC-MS/MS (n= 6)

2.4 Q-TOF/MS檢測結(jié)果

圖2 豬組織中喹諾酮類獸藥在Q-TOF/MS檢測下的整體回收率Fig. 2 Average recoveries of quinolones in porcine tissues with three sample preparation methods by Q-TOF/MS

為探索高分辨質(zhì)譜在快速識(shí)別、定量篩查豬肉中獸藥殘留的可行性，將上述處理過的同一批次樣品在選定條件下進(jìn)行Q-TOF/MS檢測。各化合物的基質(zhì)效應(yīng)均不明顯，豬組織中喹諾酮類獸藥整體回收率如圖2所示。EMR-L分別為85.67%、95.61%、98.99%，Oasis PRiME HLB分別為96.12%、87.69%、86.58%，LLE分別為73.29%、83.17%、70.26%。2 種儀器的定量結(jié)果具有相似的趨勢，由于Q-TOF/MS相對(duì)三重四極桿質(zhì)譜靈敏度較低，其檢測低限為1 μg/kg，但仍滿足我國所規(guī)定的最大殘留限量10～500 μg/kg。這體現(xiàn)了Q-TOF/MS在擁有精確定性靶向目標(biāo)物優(yōu)勢之余，同樣可以滿足對(duì)3 種方法處理過的豬組織樣品中喹諾酮類藥物進(jìn)行日常檢測的需要[29-30]。

2.5 實(shí)際樣品檢測結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證方法的可靠性，本研究采用3 種前處理方法結(jié)合三重四極桿質(zhì)譜對(duì)1 個(gè)含有NOR的豬肉陽性樣品進(jìn)行檢測，并以國標(biāo)GB/T 21312—2007《動(dòng)物源性食品中14 種喹諾酮藥物殘留檢測方法》作為對(duì)照方法。結(jié)果顯示，EMR-L、Oasis PRiME HLB、LLE和國標(biāo)4 種方法的檢測結(jié)果分別為（16.3±0.49）、（16.8±0.35）、（15.4±0.91） μg/kg和（16.6±0.27） μg/kg。EMR-L和Oasis PRiME HLB方法測定結(jié)果與國標(biāo)相近，表明這2 種商業(yè)產(chǎn)品滿足豬組織中喹諾酮類獸藥殘留的定性定量篩查。

3 結(jié) 論

本研究統(tǒng)一采用酸化乙腈作為提取溶劑沉淀蛋白促進(jìn)離子化效率，分別比較了以EMR-L為代表的QuEChERS法、以O(shè)asis PRiME HLB為代表的固相萃取法和使用正己烷去脂的LLE法，結(jié)合當(dāng)前檢測常用的兩類質(zhì)譜：三重四極桿質(zhì)譜和以Q-TOF/MS為代表的高分辨質(zhì)譜。從凈化結(jié)果來看，EMR-L與Oasis PRiME HLB凈化去脂效果均優(yōu)于LLE法，但EMR-L基質(zhì)提取物因鹽析脫水步驟導(dǎo)致鹽含量較高，重復(fù)進(jìn)樣后離子信號(hào)強(qiáng)度有一定的降低，對(duì)儀器的具體影響有待進(jìn)一步研究。從方法驗(yàn)證來看，3 種方法的檢出限、定量限及精密度滿足殘留分析要求。其中2 種商業(yè)產(chǎn)品基質(zhì)效應(yīng)不明顯，豬組織中加標(biāo)回收率均在70%～120%之間。從整體回收率看，EMR-L對(duì)于水分含量較高的豬肝、豬腎優(yōu)于Oasis PRiME HLB；相對(duì)地，脂含量較高的豬肉中Oasis PRiME HLB重復(fù)性優(yōu)于EMR-L。LLE方法所測樣品中不在70%～120%之間的比例約為12.5%。與現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)相比，EMR-L與Oasis PRiME HLB能夠縮短操作時(shí)間、節(jié)省人力和時(shí)間成本。根據(jù)高分辨和低分辨質(zhì)譜定性定量的不同，以及不同樣品基質(zhì)組成差異，選用上述2 種方法相結(jié)合的方式進(jìn)行處理檢測，可以很好地避免假陽性結(jié)果的發(fā)生。本研究系統(tǒng)性將不同前處理方法結(jié)合不同檢測手段引入豬組織的喹諾酮類獸藥殘留分析中，多角度評(píng)價(jià)了前處理方法對(duì)樣品基質(zhì)以及質(zhì)譜檢測的適用性，為當(dāng)今環(huán)境中的食品安全監(jiān)管提供了參考。