舒尼替尼對胃癌細胞BGC-823增殖的影響及機制

楊 旭 劉春靈 徐宛玲 馬永超

(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校, 漯河 462000)

胃癌在世界范圍內(nèi),其發(fā)病率和死亡率分別居第4位和第2位[1],在中國其發(fā)病率和死亡率分別居第2位和第3位。僅2011年,全球范圍內(nèi)胃癌預(yù)測新發(fā)近100萬例,死亡約70萬例[2]。近些年來,多靶點抗癌藥物研發(fā)已經(jīng)成為新型腫瘤治療藥物研發(fā)的焦點。舒尼替尼(sunitinib)是一類口服的小分子多靶點受體酪氨酸激酶抑制劑,具有抗腫瘤血管生成和直接攻擊腫瘤細胞的雙重抗腫瘤作用[3]。已有研究表明，舒尼替尼在腎細胞癌和胃腸間質(zhì)瘤,神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、乳腺癌等實體腫瘤中顯示出明顯的抗腫瘤效應(yīng)[5-6]。Notch信號通路是一類進化高度保守的細胞信號通路,其主要特點是通過細胞間的配體-受體相結(jié)合的方式發(fā)揮作用。Notch信號通路在維持細胞的自我更新、生長、分化等過程中發(fā)揮著重要作用,其在調(diào)控細胞的凋亡過程中亦起著極為重要的作用。但目前用舒尼替尼誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡及對Notch信號通路影響的研究較少,本研究通過利用不同濃度舒尼替尼對胃癌細胞的增殖、凋亡及對Notch1基因表達的影響,為胃癌的臨床治療提供重要的實驗理論基礎(chǔ),為Notch1信號通路作為潛在的治療靶點提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 化學(xué)物

舒尼替尼購自美國輝瑞,溶于二甲基亞砜(DMSO),母液濃度為100μmol/L。

1.2 細胞培養(yǎng)

人胃癌細胞系BGC-823培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100IU/ml青霉素、1μɡ/ml鏈霉素的DMEM的培養(yǎng)基中。置于含有5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱。在16cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至細胞匯合度達到80%～90%,0.5%胰蛋白酶進行消化傳代。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3 MTT法檢測BGC-823細胞的增殖

消化、收集細胞,細胞計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為2×104,每孔取100μl接種于96孔板培養(yǎng),待細胞貼壁后。加入終濃度分別為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625μmol/L 的舒尼替尼每孔150μl,每個濃度設(shè)3個復(fù)孔,對照孔只加入等量的培養(yǎng)基即可,分別作用24、48、72、96h。加入20μl MTT(5mg/ml,Sigma公司)在37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4h。之后,扣掉上清液,加入150μl DMSO,在搖床上緩慢震蕩直至藍色結(jié)晶充分溶解。利用全自動酶標儀檢測細胞在490nm波長的吸光度(OD值)。公式： 細胞增殖抑制率(%)=[1-(實驗組/對照組)]×100。計算50%細胞生長抑制所需的藥物濃度(IC50)及不同濃度的舒尼替尼對細胞增殖的抑制效應(yīng)。以藥物濃度為X軸,細胞增殖抑制率為Y軸作圖,從圖中求出半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.4 免疫熒光法檢測胃癌細胞中Notch-1的表達

對數(shù)生長期細胞接種至6孔中,加入3種藥物濃度分別作用48h后,取出細胞爬片放入干凈的6孔板中(注意正面朝上),用PBS洗滌蓋玻片3次,加入4%多聚甲醛2ml室溫靜置約30min;PBS洗滌3次每次5min,緩搖。吸干PBS,加入含0.2% Triton X-100、1% BSA的PBS約1ml;冰上靜置5min;PBS浸洗3次,每次5min。吸干PBS后于6孔板相應(yīng)孔中加入1ml 1% BSA,室溫封閉1h;PBS洗滌3次，每次5min。孵育一抗,各抗體使用1% BSA按適當?shù)味?1∶100)稀釋滴在蓋玻片上4℃緩搖過夜。陰性對照不加入一抗,使用PBS代替。孵育二抗,FITC熒光標記二抗用1%BSA按適當?shù)味?1∶500)稀釋滴在蓋玻片上,室溫避光靜置1h。加入5μg/ml DAPI染色2min,熒光顯微鏡下檢測相應(yīng)熒光強度。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測

收集不同舒尼替尼藥物濃度干預(yù)48h的細胞,預(yù)冷PBS洗細胞2次,加入1×細胞裂解緩沖液RIPA 100μl,冰浴裂解細胞30min,每10min振動一下,12000r/min離心5min,加入等體積的蛋白變性劑,100℃作用5min,備用。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移凝膠中蛋白至PVDF膜上。5%脫脂奶粉4℃封閉過夜,TBST洗膜,加入兔抗人一抗(用封閉液按1∶200稀釋)4℃孵育過夜(Notch-1、β-actin購自Sigma公司;caspase-3、caspase-9購自武漢博士德科技有限公司)。TBST洗膜3次,加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗(按1∶5000稀釋)室溫孵育1h。等體積加入A液及B液,LAS3000顯影曝光,圖像經(jīng)Image J軟件分析測定蛋白豐度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同濃度舒尼替尼、不同作用時間對細胞BGC-823增殖的抑制情況

舒尼替尼終濃度10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625μmol/L作用24、48、72、96h后顯示舒尼替尼對BGC-823細胞生長具有增殖抑制作用(圖1),抑制效果呈濃度依賴性,半數(shù)抑制率IC50為0.5928μmol/L,藥物作用時間為48h,舒尼替尼不同濃度的增殖抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 不同濃度舒尼替尼、不同作用時間對細胞增殖的影響

2.2 不同濃度舒尼替尼促進細胞BGC-823的凋亡情況

終濃度為0.25、0.50、1.00μmol/L舒尼替尼作用細胞株BGC-823 48h后,形態(tài)學(xué)及免疫熒光均顯示細胞數(shù)目明顯少于對照組,細胞核染色顯示實驗組隨著藥物濃度的增加,凋亡細胞明顯增多,細胞出現(xiàn)核固縮、體積縮小或核碎裂的現(xiàn)象,出現(xiàn)較深的藍色熒光。且隨著藥物濃度的增加,處于凋亡晚期細胞明顯增多(圖2)。通過選9個視野下的細胞進行細胞計數(shù),統(tǒng)計細胞的凋亡情況,統(tǒng)計結(jié)果見表1。免疫熒光檢測Notch-1蛋白表達實驗結(jié)果表明,舒尼替尼抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡可能是通過促進Notch-1蛋白表達發(fā)揮作用的。

表1 舒尼替尼誘導(dǎo)細胞BGC-823的凋亡率

△P<0. 05,△△P<0. 01vscontrol group

圖2 免疫熒光檢測不同濃度舒尼替尼對細胞BGC-823凋亡和Notch-1蛋白表達的影響,×100

2.3 不同濃度舒尼替尼對凋亡信號通路相關(guān)蛋白Notch-1、caspase-3、caspase-9表達的影響

0.25、0.50、1.00μmol/L舒尼替尼作用BGC-823細胞48h后,Notch-1蛋白的表達量隨藥物濃度的增加而明顯降低,同對照組相比,各濃度組舒尼替尼均能降低Notch-1蛋白的表達水平。同時,經(jīng)過舒尼替尼處理后,BGC-823細胞凋亡相關(guān)基因caspase-9、caspase-3的蛋白表達水平隨藥物濃度的增加而增加,圖像經(jīng)Image J軟件分析,結(jié)果顯示,各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),表明了這些凋亡相關(guān)基因參與了細胞凋亡的過程,實驗組與對照組相比凋亡相關(guān)蛋白表達均明顯增多(圖3)。

圖3 不同濃度舒尼替尼對胃癌細胞BGC-823蛋白表達水平的影響

3 討論

胃癌是一種源自胃部黏膜上皮的惡性腫瘤。手術(shù)治療胃癌的5年生存率僅30%左右[7],目前為止多種酪氨酸激酶抑制劑不斷大量的涌現(xiàn),但腫瘤耐藥為進一步的治療效果帶來了難題。舒尼替尼是一類新型的吲哚類口服類多靶點酪氨酸激酶抑制劑,已被用于治療腎癌(晚期)和對伊馬替尼抵抗或(失敗)的胃腸道間質(zhì)瘤[8],并且臨床研究顯示在乳腺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、非小細胞肺癌等多種腫瘤中也具有明顯的抗腫瘤效應(yīng)[9-10]。

Notch信號通路是介導(dǎo)細胞和細胞之間直接接觸的主要信號通路之一,調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡,并有研究表明其失調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),在多種腫瘤中由于其表達水平增高而起促癌的作用,如乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤;由于其復(fù)雜多樣性,而在皮膚癌、甲狀腺癌、宮頸癌等中卻起到抑癌作用[11]。Notch基因是Morgan于1917年在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的,Notch受體是由Notch基因編碼的約300kD的單跨膜蛋白[12]。Notch信號通路由Notch受體、配體、CSL-DNA 結(jié)合蛋白等組成。細胞Notch受體和配體的結(jié)合引起Notch信號通路的激活。Notch的活化形式為胞內(nèi)區(qū)域(notch intracellular domain, NICD),通過激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮一連串的生物學(xué)作用[13]。

本研究MTT結(jié)果顯示,不同終濃度舒尼替尼作用24、48、72、96h后顯示,舒尼替尼對BGC-823細胞生長具有明顯抑制作用,抑制效果呈濃度及一定的時間依賴性,不同濃度舒尼替尼的增殖抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),半數(shù)抑制率IC50為0.5928μmol/L。細胞形態(tài)學(xué)觀察可見,隨著藥物濃度的增加,細胞數(shù)目明顯減少,免疫熒光檢測顯示不同藥物濃度組隨著藥物濃度的增加凋亡細胞明顯增多,細胞出現(xiàn)核固縮、體積縮小或核碎裂的現(xiàn)象,出現(xiàn)較深的藍色熒光。且隨著藥物濃度的增加,處于凋亡晚期的細胞明顯增多。實驗結(jié)果表明,舒尼替尼抑制細胞增殖可直接通過誘導(dǎo)細胞凋亡來實現(xiàn)。免疫印跡檢測結(jié)果顯示Notch-1蛋白的表達量隨藥物濃度的增加,灰度明顯降低,同對照組相比,各濃度組舒尼替尼均能降低Notch-1蛋白的表達水平。同時,經(jīng)過舒尼替尼處理后,BGC-823細胞凋亡相關(guān)基因caspase-9、caspase-3的蛋白表達水平條帶灰度也隨藥物濃度的增加而加深,實驗組與對照組相比凋亡相關(guān)蛋白表達均明顯增多,實驗結(jié)果提示舒尼替尼作用后可以調(diào)節(jié)Notch-1的表達,誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白的表達量增加,進而促進細胞的凋亡,其中caspase-9 0.5μmol/L濃度組蛋白灰度稍淡些,考慮可能是加樣時造成的樣品量減少而引起的。

綜上所述,舒尼替尼作為一種口服酪氨酸激酶抑制劑可抑制多個靶點,通過對細胞BGC-823的Notch信號通路的調(diào)節(jié),促進胃癌細胞的凋亡,但是由于Notch信號通路的復(fù)雜多樣性,并參與多種病理和生理過程,其在不同起源的腫瘤或者同一腫瘤的不同階段,可能發(fā)揮著不同的作用,其與疾病發(fā)生的某些分子機制目前還不太明確,所以需要進一步研究Notch信號通路在疾病中的分子作用機制,為疾病的靶向藥物治療提供新的指導(dǎo)思路。