張成剛

濟(jì)南市第三人民醫(yī)院神經(jīng)外科 濟(jì)南 250132

腦膠質(zhì)瘤是一種常發(fā)于成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤，主要由神經(jīng)外胚層衍生形成，約占成人顱內(nèi)惡性腫瘤的49.7%[1]。目前對(duì)腦膠質(zhì)瘤的治療仍以手術(shù)切除為主，術(shù)后輔以放、化療，但由于腦膠質(zhì)瘤具有侵襲性高的特點(diǎn)，手術(shù)不能徹底切除癌變組織，術(shù)后復(fù)發(fā)率極高，生存率較低[2-3]。腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展與某些基因的表達(dá)異常有關(guān)[4]，探索新的治療靶點(diǎn)對(duì)治療具有重要意義。胞質(zhì)多聚腺苷酸化元件結(jié)合蛋白4(cytolasmic polydenylation element-binding protein 4,CPEB4)是一類(lèi)能與RNA特異性結(jié)合的蛋白[5]，其在胰腺癌[6]及腦膠質(zhì)瘤[7]中具有較高的表達(dá)，可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)、侵襲遷移、凋亡及血管生成等[8]，但是相關(guān)作用機(jī)制還不清楚。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)人腦膠質(zhì)瘤組織中CPEB4的表達(dá),并觀察用siRNA沉默CPEB4基因以及用JAK2/STAT3信號(hào)抑制劑AG490下調(diào)CPEB4表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87增殖、遷移能力的影響，以期為靶向CPEB4治療人腦膠質(zhì)瘤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1腦膠質(zhì)瘤組織中CPEB4的表達(dá)

1.1.1 組織來(lái)源 收集2012年7月至2017年6月在濟(jì)南市第三人民醫(yī)院及山東省千佛山醫(yī)院手術(shù)切除的新鮮腦膠質(zhì)瘤組織及相應(yīng)的癌旁正常組織40例，均經(jīng)病理證實(shí)?；颊吣?8例，女12例，中位年齡48.2歲。

1.1.2 組織中CPEB4 mRNA的檢測(cè) 每例樣本取50 mg組織，剪碎后加入1 mL Trizol(美國(guó) Invitrogen公司)進(jìn)行勻漿，將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，混勻后于室溫靜置5 min，加入200 μL氯仿劇烈振蕩15 s，4 ℃12 000 r/min離心15 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中并加入等體積預(yù)冷的異丙醇，混勻后置于冰上10 min，離心取沉淀，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗滌2次，晾干后用20 μL DEPC水溶解沉淀，微量核酸儀檢測(cè)RNA濃度。利用PrimerScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)說(shuō)明操作。引物由上海生工生物工程有限公司合成。采用2-ΔΔCt法計(jì)算CPEB4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。CPEB4上游引物序列：5’-TGGGGATCAGCCTCTTCATA-3’,下游引物序列：5’-CAATCCGCCTACAAACACCT-3’。內(nèi)參GAPDH上游引物序列：5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTT-3’，下游引物序列：5’- AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。

1.2沉默CPEB4基因后U87細(xì)胞增殖和遷移能力的變化

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分3組，對(duì)照組、無(wú)義siRNA組及CPEB4 siRNA組。以5×105mL-1將U87細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到75%時(shí)，無(wú)義siRNA組及CPEB4 siRNA組參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒(美國(guó) Invitrogen公司)說(shuō)明操作，分別轉(zhuǎn)染無(wú)義siRNA和CPEB4 siRNA；對(duì)照組不轉(zhuǎn)染。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。CPEB4 siRNA及無(wú)義siRNA均由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成，正義鏈序列分別為5’-GCAAAGCAATACTGGGAAT-3’和5’-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3組細(xì)胞，置于37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，向細(xì)胞中加入5 g/L MTT(上海華美生物工程公司)10 μL，37 ℃孵育4 h，棄上清，加100 μL DMSO溶液振蕩培養(yǎng)至結(jié)晶物完全融化，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度(A)，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照A。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3組細(xì)胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化后，離心取沉淀，用新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基重懸后接種至24孔板，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。使用移液槍槍頭在貼壁細(xì)胞中小心劃一條細(xì)痕，PBS洗滌后加入細(xì)胞培養(yǎng)液，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。倒置顯微鏡下觀察，血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀中心計(jì)數(shù)線邊緣為1/4 mm，邊緣計(jì)數(shù)線最小長(zhǎng)方形長(zhǎng)為(1/4×5) mm。分別于培養(yǎng)0、48 h時(shí)于400倍顯微鏡下測(cè)定20個(gè)細(xì)胞向劃痕中心移動(dòng)的距離，即為遷移距離。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中不同蛋白的表達(dá)轉(zhuǎn)染48 h后，收集3組細(xì)胞，裂解，利用BCA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取50 μg蛋白與Loading buffer充分混合，100 ℃煮沸5 min制備上樣蛋白。將上樣蛋白完全加入到SDS-PAGE上樣孔中進(jìn)行電泳，電壓80 V電泳30 min后，調(diào)整電壓為120 V繼續(xù)電泳直至結(jié)束。取出蛋白膠，4 ℃條件下將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用50 g/L脫脂奶粉封閉3 h，依次加入抗CPEB4、MMP-9、MMP-2、STAT3、p-STAT3、JAK2和p-JAK2一抗(抗體均來(lái)源于美國(guó)Abcaminc公司，稀釋度均為1∶500)，加二抗(稀釋度為1∶1 000)，然后ECL發(fā)光劑顯影，利用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.3抑制JAK/STAT3信號(hào)通路后U87細(xì)胞增殖及遷移能力的變化實(shí)驗(yàn)分為3組，對(duì)照組、AG490(美國(guó)Sigma公司)組與AG490+CPEB4 siRNA組。對(duì)照組為不經(jīng)任何處理的U87細(xì)胞，AG490組用50 μmol/L的AG490處理U87細(xì)胞48 h，AG490+CPEB4 siRNA組用50 μmol/L的AG490處理轉(zhuǎn)染CPEB4 siRNA的U87細(xì)胞48 h。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖和遷移能力的檢測(cè)方法同1.2.3和1.2.4,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。腦膠質(zhì)瘤和相應(yīng)癌旁正常組織中CPEB4 mRNA表達(dá)水平的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；3組細(xì)胞間CPEB4、MMP-9、MMP-2、STAT3、p-STAT3、JAK2和p-JAK2蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞存活率和遷移距離的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1CPEB4mRNA在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)與癌旁正常組織中相對(duì)表達(dá)量(0.964±0.074)相比，腦膠質(zhì)瘤組織中CPEB4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(3.664±0.321)顯著升高(t配對(duì)=14.196，P<0.001)。

2.2沉默CPEB4基因?qū)87細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

2.2.1 3組細(xì)胞中CPEB4蛋白表達(dá)水平的比較結(jié)果見(jiàn)圖1、表1，對(duì)照組及無(wú)義iRNA組CPEB4蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CPEB4 siRNA組CPEB4蛋白表達(dá)水平較2個(gè)對(duì)照組降低(P<0.05)。

2.2.2 3組細(xì)胞增殖及遷移能力的比較 3組細(xì)胞存活率及遷移距離測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。對(duì)照組與無(wú)義RNA組細(xì)胞存活率及遷移距離差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CPEB4 siRNA組細(xì)胞存活率及遷移距離較2個(gè)對(duì)照組降低(P<0.05)。

2.2.3 3組細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、STAT3、p-STAT3、JAK2和p-JAK2蛋白表達(dá)水平的比較 見(jiàn)圖2、表2。對(duì)照組與無(wú)義siRNA組這6種蛋白的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CPEB4 siRNA組這6種蛋白的表達(dá)水平均較2個(gè)對(duì)照組降低(P<0.05)。

1：對(duì)照組；2：無(wú)義RNA組；3：CPEB4 siRNA組

圖1 3組U87細(xì)胞中CPEB4蛋白的表達(dá)表1 3組細(xì)胞中CPEB4蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞存活率及遷移距離的比較

*：與其他2組相比，P<0.05

1：對(duì)照組；2：無(wú)義siRNA組；3：CPEB4 siRNA組圖2 3組細(xì)胞中JAK/STAT3通路蛋白的表達(dá)表2 3組細(xì)胞中JAK/STAT3通路蛋白表達(dá)的比較

組別nMMP-9 MMP-2 STAT3 p-STAT3 JAK2 p-JAK2對(duì)照組 3 0.426±0.038 0.302±0.028 0.324±0.032 0.138±0.015 0.387±0.042 0.177±0.020無(wú)義siRNA組 3 0.454±0.041 0.296±0.026 0.331±0.034 0.140±0.016 0.366±0.040 0.189±0.021CPEB4 siRNA組 3 0.157±0.018* 0.141±0.015* 0.132±0.014* 0.036±0.006* 0.145±0.017* 0.042±0.007*F 70.174 44.494 48.304 61.578 44.284 67.379P<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

*：與其他2組相比，P<0.05

2.3抑制JAK/STAT3信號(hào)通路對(duì)U87細(xì)胞增殖及遷移能力的影響結(jié)果見(jiàn)表3。與對(duì)照組相比，AG490組與AG490+CPEB4 siRNA組細(xì)胞存活率和遷移距離均降低(P<0.01)；與AG490組相比，AG490+CPEB4 siRNA組細(xì)胞存活率與遷移距離更低(P<0.05)。

表3 3組細(xì)胞存活率與遷移能力的比較

*：與對(duì)照組相比，P<0.05；#：與AG490組相比，P<0.05

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康的惡性腫瘤之一，由于具有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的特點(diǎn)，手術(shù)難以完全切除，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，生存期僅為6～12個(gè)月。隨著基因工程的發(fā)展，人們逐漸開(kāi)始從分子生物學(xué)的角度探求膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制，并希望從基因水平尋找到治療的方法。

CPEB4基因位于人類(lèi)染色體的5q21，含有一個(gè)RNA識(shí)別序列及一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度為7 769 bp[9]，表達(dá)后定位于細(xì)胞質(zhì)。有研究[10]認(rèn)為，CPEB4是一種神經(jīng)細(xì)胞存活蛋白，在腫瘤發(fā)展過(guò)程中，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)具有重要作用，可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、血管的生成及侵襲的發(fā)生。已有報(bào)道CPEB4在皮膚癌[11]、結(jié)直腸癌[12]及肝癌[13]中過(guò)表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)CPEB4在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)較癌旁正常組織顯著升高。

本研究發(fā)現(xiàn)，利用RNAi技術(shù)抑制腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中CPEB4的表達(dá)后，U87細(xì)胞的增殖和遷移能力降低。MMP-2是鋅離子依賴蛋白水解酶，由腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞分泌，激活后能特異降解基底膜Ⅳ型膠原，改建細(xì)胞外基質(zhì)，繼而促進(jìn)腫瘤新生血管形成，促進(jìn)腫瘤的遷移與侵襲[14]。MMP-9以酶原的形式分泌，活化后形成Ⅳ型膠原酶，破壞腫瘤表面細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向周?chē)M織浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，導(dǎo)致腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移[15]。本研究結(jié)果顯示，抑制CPEB4表達(dá)后U87細(xì)胞中MMP-2和MMP-9表達(dá)水平下降，說(shuō)明CPEB4可能通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9的表達(dá)影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移。

JAK/STAT3信號(hào)通路廣泛存在于真核生物中，由多種細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子參與，在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、免疫等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[16]。外界刺激可能使細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子與細(xì)胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合，活化JAKs，激活胞質(zhì)中的STATs，活化后的STATs進(jìn)入細(xì)胞核與靶基因結(jié)合，啟動(dòng)下游基因表達(dá)[17]。研究[18]表明JAK/STAT信號(hào)通路參與了腦部發(fā)育，在神經(jīng)細(xì)胞分化、再生等方面具有重要作用。STAT3被報(bào)道參與腦膠質(zhì)瘤的增殖、遷移、凋亡等過(guò)程[19]。AG490是JAK2特異性拮抗劑，能特異性阻斷JAK/STAT3信號(hào)通路。本研究結(jié)果顯示,利用siRNA抑制CPEB4表達(dá)后U87細(xì)胞中JAK2及STAT3表達(dá)下調(diào)；AG490可降低U87細(xì)胞的增殖與遷移能力，與CPEB4 siRNA作用方向一致；AG490+CPEB4 siRNA組細(xì)胞增殖與遷移能力較AG490組更低。說(shuō)明CPEB4促進(jìn)U87細(xì)胞的增殖與遷移與上調(diào)JAK/STAT3信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，CPEB4在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)上調(diào)，能夠促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移，其作用機(jī)制可能與JAK/STAT3信號(hào)通路有關(guān)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究CPEB4在腦膠質(zhì)瘤發(fā)病中的作用奠定了基礎(chǔ)，為臨床靶向治療提供了理論依據(jù)。