楊 兵，林愛琴，羅曉華，劉莉萍

1)鄭州鐵路職業(yè)技術學院護理學院內科護理教研室 鄭州 451460 2)鄭州大學第五附屬醫(yī)院心血管內科 鄭州 450052

冠心病是由動脈粥樣硬化引起的最常見的器官病變之一。動脈粥樣硬化是機體脂質代謝異常及多因素引起的一種特殊的慢性炎癥反應[1]，大量的免疫細胞參與其中。近年來，適應性免疫在動脈粥樣硬化中的作用得到了廣泛的關注[2]。越來越多的研究證實，CD4+T 細胞的活化在機體炎癥反應介導的自身免疫應答中發(fā)揮著重要的作用，其中Treg和Th17細胞的平衡在抑制自身免疫應答、維持免疫穩(wěn)態(tài)中起著至關重要的作用[3]，Treg/Th17細胞比值被證明是動脈粥樣硬化斑塊脆弱性的敏感指標[4]。本文對冠心病患者外周血中Treg/Th17細胞比值及相關因子進行檢測，為進一步探討冠心病的發(fā)病機制提供理論基礎。

1 對象與方法

1.1研究對象選取2017年1月至2018年1月于鄭州大學第五附屬醫(yī)院經冠狀動脈造影確診為冠心病的患者61例。A組13例，為輕度冠心病患者(冠狀動脈狹窄程度<30%)；B組和C組分別在(16.4±8.4)和(20.2±9.7)個月前行冠狀動脈支架植入術,B組為無冠狀動脈粥樣硬化進展患者15例，C組為在原冠狀動脈中有進行性冠狀動脈粥樣硬化患者(新的狹窄超過50%)15例；D組18例，為存在3支冠狀動脈病變且不能行支架植入術的嚴重冠心病患者。納入標準：①符合國際心臟病學會冠心病的診斷標準。②所有患者自愿參加本研究并簽署知情同意書。排除標準：①近6個月發(fā)生過急性心肌梗死。②有自身免疫病及自身免疫病史的患者。③瓣膜性心臟病(風濕性心臟病等)。④合并腎病或者其他重要臟器功能不全者。⑤近期服用過免疫抑制藥物、非甾體類抗炎類藥、類固醇等可能影響外周血中Treg 細胞水平的藥物。⑥患有惡性腫瘤或有腫瘤史的患者。

1.2標本的采集取早晨空腹靜脈血2 mL于加入肝素的無菌管中，加入Ficoll淋巴細胞分離液梯度離心獲取人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell， PBMC)，用于外周血中 Treg和Th17 細胞檢測；另取不加肝素的靜脈血2 mL，離心后分離血清，保存在-80 ℃的冰箱中，用于細胞因子的檢測。

1.3流式細胞術檢測外周血Treg細胞每個樣本用2支FCM試管，分別標記對照管和實驗管，每個FCM管中加 2×106個PBMC，向對照管中滴加CD4-PE和IgG-FITC 抗體各10 μL，實驗管中加入 CD25-PE和CD4-FITC 抗體各 10 μL，振蕩搖勻后室溫避光孵育 30 min，清洗，離心去上清；加入破核固定液，室溫避光孵育 20 min，清洗，離心去上清；用 300 μL PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測 Treg 細胞。

1.4流式細胞術檢測外周血Th17細胞用RPMI 1640培養(yǎng)液重懸PBMC，加入佛波酯、離子霉素和莫能霉素，置于37 ℃、體積分數5% CO2培養(yǎng)箱孵育 4 h，收集細胞，清洗，離心去上清，每個流式管內加入100 μL密度為 2×106mL-1的 PBMC，加入鼠血清封閉細胞表面FcR， 4 ℃孵育30 min；加入 10 μL CD4-Percp抗體，混勻，4 ℃避光孵育 30 min，清洗，離心去上清；加入破膜液，室溫避光孵育 30 min，清洗，離心去上清后加入 IL-17A-PE 抗體，室溫孵育 30 min，清洗，離心去上清；用 300 μL PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測Th17細胞。

1.5外周血血清中IL-10、IL-17和TGF-β水平的檢測采用ELISA法。取保存于-80 ℃冰箱中的血清，用雙抗夾心的ELISA試劑盒檢測患者外周血清中IL-10、IL-17和TGF-β水平，具體操作步驟按美國R&D 公司的ELISA試劑盒說明書進行。

1.6統計學處理采用SPSS 22.0對數據進行統計分析。4組患者外周血Treg、Th17細胞及其比值和血清TGF-β、IL-10、IL-17水平的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；4組患者一般臨床資料的比較采用χ2檢驗或單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組患者一般臨床資料的比較4組患者的年齡、性別構成、高血壓發(fā)生率、總膽固醇與甘油三酯水平比較，差異均無統計學意義，見表1。

表1 4組患者一般臨床資料比較

2.2各組患者外周血中Treg、Th17細胞和Treg/Th17比值的比較結果見表2?？芍?，4組患者外周血中Treg、Th17細胞和Treg/Th17比值比較，差異均有統計學意義。與A組相比，D組外周血中Treg細胞和Treg/Th17比值降低，Th17細胞比例升高。

表2 4組患者外周血中Treg和Th17細胞及Treg/Th17比值的比較

*：與A組相比，P<0.05

2.3各組患者血清中IL-10、IL-17和TGF-β水平的比較結果見表3?？芍?組患者血清IL-10和IL-17水平比較，差異有統計學意義；且兩兩比較結果顯示，D組患者血清IL-10水平低于A、B、C組。

表3 4組患者血清中IL-10、IL-17和TGF-β 水平的比較 ng/L

*：與A組相比，P<0.05

3 討論

動脈粥樣硬化的發(fā)病機制曾有多種學說，包括脂質浸潤學說、血栓形成學說、炎癥學說，是動脈壁的一種炎癥性疾病[5]。而冠心病是動脈粥樣硬化導致器官病變的常見類型之一，多發(fā)生在40歲以上男性，近年來發(fā)病呈年輕化趨勢，是目前全世界病死率最高的疾病之一[6]。Treg細胞與Th17細胞是近年來新發(fā)現的CD4+T細胞的兩種亞型，由于相互拮抗而備受關注[7]。Treg/Th17比值已經成為免疫炎性疾病領域中研究的新熱點。Treg 細胞主要通過分泌 IL-10 和 TGF-β 等抗炎因子，或直接與細胞接觸發(fā)揮抗炎與免疫抑制作用[8]。研究[9]表明在動脈粥樣硬化、高血壓、缺血性卒中等心血管疾病患者中均出現Treg細胞的減少和功能的下降。

Th17 細胞分泌IL-6、IL-8 和 IL-17 等多種促炎因子發(fā)揮促炎作用，其作用在心血管疾病如風濕性心肌病、動脈粥樣硬化、心肌炎等中也得以證實[10]。該研究結果顯示，與輕度冠心病患者相比，有進行性冠狀動脈粥樣硬化患者和嚴重冠心病患者的外周血中Treg細胞及Treg/Th17比值降低，而Th17細胞升高，提示有進行性冠狀動脈粥樣硬化患者和嚴重冠心病患者Treg/Th17細胞向Th17細胞分化的趨勢增強。

Treg/Th17細胞的功能受細胞頻率、分泌相關細胞因子和關鍵轉錄因子水平的影響。研究[11-12]證實，外周血中Treg細胞降低，Treg相關細胞因子如IL-10和TGF-β、轉錄因子水平顯著降低，Th17細胞、Th17相關細胞因子如IL-17、IL-6、IL-23、轉錄因子水平增加多發(fā)生在不穩(wěn)定性心絞痛患者和心肌梗死患者中。IL-10是一種重要的體內抗炎細胞因子，它既能抑制單核細胞的活性，又能抑制TNF-α、IL-6、IL-8 等炎癥因子的產生，減輕炎癥對血管的損傷。該研究結果亦表明，存在3支冠狀動脈病變且不能行支架植入術的嚴重冠心病患者外周血中IL-10水平顯著低于程度較輕的冠心病患者。有學者[13]通過對 IL-17 以及 IL-17 誘導的IL-6、IL-8 在不穩(wěn)定心絞痛患者血清中表達的對比，發(fā)現IL-17 在冠心病患者中的高表達是導致斑塊不穩(wěn)定、破裂的重要因素。此外，又有研究[14]表明，使用IL-17A抗體中和處理后，小鼠動脈粥樣硬化斑塊的進展明顯受到抑制。表明糾正IL-10/IL-17細胞因子的平衡亦可以調節(jié)冠心病患者體內炎癥平衡的狀態(tài)。

綜上所述，冠心病患者冠狀動脈病變的嚴重程度與Treg/Th17比值可能有關，可以將Treg/Th17比值作為冠心病輔助診斷、判斷預后的關鍵指標。