陳倩楠 王 軻 湯 沙 杜麗璞 智 慧 賈冠清 趙寶華葉興國 刁現民,*

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以抗除草劑基因穩(wěn)定轉化谷子技術研究

陳倩楠1,2王 軻1湯 沙1杜麗璞1智 慧1賈冠清1趙寶華2葉興國1刁現民1,*

1中國農業(yè)科學院作物科學研究所, 北京 100081;2河北師范大學生命科學學院, 河北石家莊 050024

農桿菌介導的谷子遺傳轉化效率一直是制約谷子功能基因研究及轉基因育種效率的主要因素。本研究以冀谷11谷子幼穗為外植體, 選取0.5~1.0 cm的幼穗, 切成0.5 cm左右的小段, 置改良后的MS培養(yǎng)基上誘導15~20 d形成胚性愈傷組織3120塊。愈傷組織侵染轉化前用侵染液懸浮浸泡, 并經45°C熱激預處理3 min, 可以有效提高26.1%的瞬時遺傳轉化效率。將轉化后的愈傷組織經草丁膦(PPT)篩選后獲得513塊抗性愈傷組織, 抗性愈傷組織獲得率為16.4%?？剐杂鷤M織經分化、壯苗培養(yǎng)后獲得7株抗性植株, 經PCR和Southern雜交檢測得到6株T0代轉基因陽性株, 對T3代轉化植株葉片進行PPT抗性分析, 并結合Bar蛋白抗體試紙條鑒定, 表明基因已穩(wěn)定整合到谷子基因組中。本研究建立了農桿菌介導轉化谷子優(yōu)良品種的遺傳轉化體系, 對提高谷子轉基因育種效率和谷子模式研究系統的建立有重要意義。

谷子; 根癌農桿菌; 遺傳轉化; 熱激; 抗除草劑

谷子((L.) Beauv.)在植物分類系統中處于禾本科(Gramineae)黍亞科(Panicoideae)狗尾草屬(), 其野生祖先種是青狗尾草()[1]。我國黃河流域是谷子的發(fā)源地, 谷子在我國有著極其悠久的栽培歷史。谷子籽粒脫皮后俗稱“小米”, 營養(yǎng)價值均衡, 蛋白質、脂肪酸含量高, 富含豐富的維生素和微量元素[2]。我國也是谷子種植面積最大的國家, 占世界谷子種植總面積的88%。谷子作為抗旱節(jié)水作物, 在應對未來干旱環(huán)境和全球氣候變暖導致的糧食減產風險中有著戰(zhàn)略儲備作物的意義。谷子是C4植物, 二倍體自花授粉, 基因組小, 生育周期短, 耐旱耐貧瘠, 抗逆性強, 適應性廣, 正在逐漸發(fā)展成為研究C4植物光合作用和抗旱耐貧瘠的模式作物[3-4]。

目前, 有關谷子遺傳轉化的報道相對較少, 最早的谷子轉基因研究報道是董云州等[5-6]利用基因槍法轟擊谷子花粉。之后, 刁現民等[7]利用基因槍法轟擊谷子胚性愈傷組織, 成功建立了谷子的轉化體系, 但該方法的轉化效率依然偏低。王永芳等[8]最先利用根癌農桿菌介導法進行谷子的遺傳轉化研究, 谷子的基因轉化驗證研究處于起步階段。過表達基因的冀谷11轉基因植株會導致其分蘗數增加[9];基因轉化冀谷11胚性愈傷組織, 轉基因植株會出現多種異常發(fā)育的花藥[10]; 李叢[11]在冀谷11中超表達基因提高了轉基因谷子的耐旱性。青狗尾草作為谷子的野生近緣種, 近年來其轉化效率有了重大突破, 美國康奈爾大學Boyce Thompson植物研究所, 以青狗尾草A10作為材料, 成功建立了其農桿菌遺傳轉化技術體系, 轉化效率接近20%[4]; 近幾年相繼有2篇文章報道通過花粉管通道與農桿菌介導相結合的方法成功獲得可穩(wěn)定遺傳的轉基因植株, Martins等[12-13]與Saha等[14]將外源基因通過載體構建的方式轉入農桿菌中, 制成農桿菌懸浮液, 通過蘸花法也獲得了轉基因陽性植株, 但這種蘸花法在國際上多個實驗室難以重復。目前國內外谷子的轉基因研究均處于轉基因體系構建和優(yōu)化過程中, 尚無具有應用價值的谷子轉基因成型材料。隨著谷子研究價值的不斷提高, 谷子的遺傳轉化技術也越來越重要。

在植物轉基因研究中, 抗性標記基因的使用可以有效地從非轉化細胞中篩選獲得轉化體。目前經常使用的抗性標記基因大多數是抗生素或除草劑抗性基因, 如潮霉素磷酸轉移酶基因()[15]、新霉素磷酸轉移酶基因()[16]、草丁膦抗性基因()[17]、草甘膦抗性基因()[18]等。隨著轉基因植物的大量推廣, 人們越來越關注抗性標記滯留植物體內并表達是否對植物體本身或其他有利性狀基因的表達產生影響, 因此, 提高轉基因植物選擇標記基因的安全性成為研究熱點。基因是迄今為止用得最多的一個抗除草劑基因, 其編碼的PPT乙酰轉移酶可有效水解培養(yǎng)基中PPT及其類似物Basta、Bialaphos等, 使植物體內谷氨酰胺合成途徑能夠正常進行, 免除體內氨離子積累對植物細胞的毒害作用[19], 作為選擇標記基因也成功被用于不同物種的遺傳轉化[20]。張曉東等[21]將小麥中編碼HMW谷蛋白5和10亞基的基因和基因重組, 用基因槍法轉化小麥幼胚、幼穗和花藥, 獲得了Basta抗性植株。傅榮昭等[22]將抗除草劑基因與雄性不育基因緊密連接, 創(chuàng)造了新的雄性不育轉基因材料。黃大年等[23]將基因導入雜交水稻的恢復系, 也成功獲得了可用于生產的抗除草劑雜交水稻。

由于大規(guī)模地、連續(xù)性地使用除草劑, 農田雜草已對除草劑產生抗性, 若單純提高除草劑的使用濃度以達到殺死雜草的目的, 則容易對農作物產生毒害作用。因此, 育成抗除草劑的作物新品種已成為育種工作者的一個重要課題。谷子生產一直采用大量播種、人工間苗的栽培方式, 普通谷子品種缺乏適宜的除草劑, 所以谷田除草一直靠人工作業(yè), 體力勞動繁重[24]。谷子本身又不具備抗除草劑或耐除草劑基因, 經育種工作者的長期研究, 在谷子的近緣野生種狗尾草中發(fā)現多個抗除草劑基因[25-27]。王天宇等[24,28]將源于狗尾草的多個不同類型的抗除草劑基因轉移到栽培種上, 獲得了抗三類實用有效除草劑(阿特拉津、氟樂靈、拿撲凈)的新種質。

本試驗以谷子幼穗為外植體, 利用基因作為選擇標記基因, 旨在構建谷子穩(wěn)定的遺傳轉化體系, 并創(chuàng)制谷子抗除草劑新材料, 為利用組織培養(yǎng)和基因工程技術開展谷子功能基因組學的研究和谷子抗除草劑育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用冀谷 11, 種植于中國農業(yè)科學院作物科學研究所北京順義試驗站(夏季)和海南三亞試驗站(冬季)。

植物表達載體pWMB111、農桿菌C58C1由中國農業(yè)科學院作物科學研究所轉基因中心小麥轉化組提供。pWMB111載體是由Ubi啟動子同時調控的基因和基因。

1.2 培養(yǎng)基成分

遺傳轉化所用的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基, 添加不同添加物后構成不同培養(yǎng)階段所用培養(yǎng)基(表1)。

表1 農桿菌介導谷子愈傷組織轉化培養(yǎng)基配方

所有培養(yǎng)基pH值均為5.8; IL侵染液使用前過濾除菌;a需過濾除菌, 培養(yǎng)基滅菌完成后再添加。

All medium pH values are 5.8; IL should be sterilized before use;ashould be filtered, and add into medium after medium sterilization.

VC: vitamin C; 2,4-D: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid; KT: kinetin; NAA:1-naphthaleneacetic acid; AS: acetosyringone; Cef: cefetamet pivoxil; Carb: carbenicillin; Tim: timentin; PPT: phosphinothricin; IM: induction medium; IL: infection liquid; CM: co-culture medium; RM: recovery medium; SM: screening media; DM: differentiation medium; SSM: strong seedling medium.

1.3 試驗方法

1.3.1 取樣和幼穗愈傷組織培養(yǎng) 種植谷子材料, 當其進入孕穗期后每2天取一次樣, 獲得不同大小的幼穗, 至幼穗大于等于2.0 cm后停止取樣。剝去苞葉, 用75%的酒精噴拭葉鞘表面, 于超凈臺內用無菌手術刀及鑷子將葉鞘內的幼穗小心取出, 切成0.5 cm左右的小段, 接種于誘導培養(yǎng)基上, 28°C暗培養(yǎng)以誘導愈傷組織。分別設置7、15、30 d誘導時間, 保證每個處理均包含不同生長長度的幼穗材料。將誘導7、15、30 d的幼穗進行農桿菌侵染轉化, 恢復培養(yǎng)3 d后, 檢測基因的瞬時表達效率。

1.3.2 農桿菌介導的遺傳轉化 將胚性愈傷組織作為受體, 進行遺傳轉化熱激處理(表2), 保證每個處理均包含不同生長長度的幼穗材料。然后4°C 6457×低溫離心10 min; 加入無菌IL侵染液(含有100 μmol L–1的AS)重懸, 獲得OD600=1.0的農桿菌懸浮液, 室溫靜置侵染10 min, 吸干愈傷組織表面的菌液, 在AS培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2 d, 恢復培養(yǎng)3 d后, 再將其轉移到含有PPT的篩選培養(yǎng)基, 培養(yǎng)4周完成篩選。將篩選后得到的抗性愈傷組織轉移至分化培養(yǎng)基中培養(yǎng), 待分化芽長至2~4 cm時轉移至生根培養(yǎng)基中。再生苗長到約8 cm根系較健壯時, 開蓋煉苗3~4 d, 最后將去除培養(yǎng)基的再生苗移入試驗地或進行盆栽。

表2 遺傳轉化熱激處理方式

1.3.3 轉基因植株的PCR鑒定 利用SDS法分別提取T0代轉基因植株和未轉化植株全基因組DNA。PCR擴增基因片段的引物F: 5′-GCA CCATCGTCAACCACTAC-3′; R: 5′-TGAAGTCCAG CTGCCAAAA-3′; r酶(TaKaRa, 日本)檢測PCR擴增體系為20 μL。反應程序為95°C變性5 min; 95°C變性40 s, 55°C退火40 s, 72°C延伸30 s, 30個循環(huán); 72°C延伸10 min。取PCR產物10 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4 Southern雜交 利用SDS法提取的高質量總DNA 20~30 μg, 經I和d III限制性內切酶完全消化后, 在0.8%瓊脂糖凝膠電泳上分離。參照Sambrook等[29]的方法將DNA轉至帶正電荷的尼龍膜上。探針為以pWMB111質粒為模板經PCR擴增的基因片段, 探針的標記以及雜交過程參考DIG High Prime DNA labeling and Detection Starter Kit II(Roche, 美國)的說明書。利用化學發(fā)光檢測體系(UVP, 美國)進行免疫檢測。

1.3.5 谷子轉基因植株后代的檢測 通過常規(guī)PCR法及Bar蛋白抗體試紙條法(取2 cm左右的葉片, 液氮速凍破碎; 加入0.3 mL的Extractin buffer, 將試紙條標有指示箭頭的一端浸入buffer內, 靜待2 min, 觀察Bar蛋白抗體表達結果), 調查T1代轉基因植株中基因分離比例, 同時又對處于5~6葉期野生型及T3代轉基因植株進行PPT抗性分析, 即分別用0、2.5、5 g L–1PPT溶液涂抹野生型及T3代轉基因植株新葉, 生長1周后, 觀察統計植株存活率。

1.3.6 數據處理公式

愈傷組織出愈率(%)=(形成愈傷組織數/接種幼穗數)×100%

愈傷組織分化率(%)=(分化苗愈傷組織數/愈傷組織數)×100%

瞬時轉化效率(%)=(染色后藍斑的愈傷組織數/愈傷組織總數)×100%

2 結果與分析

2.1 幼穗大小及誘導培養(yǎng)時間對于愈傷組織狀態(tài)的影響

本研究人為的將谷子幼穗長度分為5個級別, 試驗發(fā)現在其他試驗條件相同時, 不同長度的幼穗愈傷組織誘導率不同(圖1-D和表3)。當幼穗長度在0.5~1.0 cm時, 愈傷組織的誘導效率最高, 可達到92.74%, 此時的愈傷組織為淡黃色, 質地緊密, 狀態(tài)最佳。在相同培養(yǎng)條件下, 愈傷組織誘導培養(yǎng)時間影響胚性愈傷組織的形成。誘導培養(yǎng)時間為7 d時, 幼穗細胞未經脫分化形成愈傷組織, 不具有全能性(圖1-A); 愈傷組織誘導時間為15 d時, 多為淡黃色、質地緊密的胚性愈傷組織(圖1-B); 誘導培養(yǎng)時間為30 d時, 愈傷組織狀態(tài)會急劇下降, 并出現大量白色芽狀體, 喪失分化能力(圖1-C)。

2.2 愈傷組織誘導培養(yǎng)時間對于谷子遺傳轉化效率的影響

當愈傷組織誘導時間為15 d時, 形成的愈傷組織較多(圖2-B),染色檢測表明瞬時轉化效率在52%左右(圖2-D, E), 且后期經過兩輪篩選后, 愈傷組織還能保持較高的分化能力。愈傷組織誘導培養(yǎng)時間為7 d時(圖2-A), 愈傷組織的轉化效率在50%左右, 與誘導培養(yǎng)15 d的愈傷組織轉化效率無顯著性差異, 但后期經過轉化篩選, 分化能力差; 愈傷組織誘導培養(yǎng)時間為30 d時(圖2-C), 愈傷組織的轉化效率顯著降低, 僅在30%左右(圖2-D, F), 此時的胚性愈傷組織數量急劇減少, 且在篩選過程中出現大量白色芽體, 分化能力降低。

圖1 幼穗大小及愈傷組織狀態(tài)

A: 誘導7 d后愈傷組織; B: 誘導20 d后愈傷組織; C: 誘導40 d后愈傷組織; D: 不同長度幼穗。

A: calli after induction for 7 d; B: calli after induction for 20 d; C: calli after induction for 40 d; D: young panicles in different sizes.

表3 幼穗誘導培養(yǎng)15 d后愈傷組織誘導效率的比較

愈傷組織誘導率(%)是指每100個幼穗中可誘導出的愈傷組織的幼穗個數。a3次重復的平均值±標準差。

Calli induction rate (%) refers to the number of inducible calli per 100 panicles.aMean of three repeats ± standard deviation.

圖2 愈傷組織誘導培養(yǎng)時間對轉化效率的影響

A: 誘導7 d后愈傷組織; B: 誘導15 d后愈傷組織; C: 誘導30 d后愈傷組織; D:瞬時轉化效率; E: 誘導15 d愈傷組織染色; F: 誘導30 d愈傷組織染色。*, **分別表示在≤ 0.05和≤ 0.01水平上的顯著差異。

A: calli after induction for 7 d; B: calli after induction for 15 d; C: calli after induction for 30 d; D:transient conversion efficiency; E:staining of calli after induction for 15 d; F:staining of calli after induction for 30 d. *and** indicates a significant difference at≤ 0.05 and≤ 0.01 levels, respectively.

2.3 熱激處理對谷子遺傳轉化效率的影響

熱激可以提高質粒的轉化效率, 本試驗設計了25°C (CK)、37°C、45°C、47°C共4個預處理溫度, 以3 min為熱激預處理時間進行試驗。染色數據表明, 適當的熱激有利于提高谷子愈傷組織的基因瞬時表達率。37°C 3 min熱激后愈傷組織的基因染色效率與對照無顯著差異; 45°C 3 min熱激處理可以提高愈傷組織中基因瞬時表達效率, 比對照組平均提高了26.1%的瞬時轉化效率; 47°C熱激預處理對于農桿菌介導的愈傷組織瞬時表達有著抑制作用, 比對照組平均降低了8.4% (圖3-A)。

對45°C熱激溫度設計了4組熱激時間的試驗, 恢復培養(yǎng)3 d后,染色數據統計顯示, 熱激溫度為45°C, 熱激時間為3 min有利于瞬時轉化效率的提高, 差異極顯著(圖3-D~F)。熱激時間為1.5 min時,表達效率與對照無顯著差異, 熱激時間為5 min時,瞬時轉化效率低于對照組。試驗結果表明, 45°C 3 min的熱激時間能顯著提高瞬時轉化效率, 而45°C 5 min的熱激處理對其瞬時遺傳轉化有抑制作用。

圖3 谷子愈傷組織熱激處理GUS瞬時轉化

A: 不同溫度下熱激3 min的瞬時表達率; B: 25°C (CK)染色; C: 45°C熱激下染色; D: 45°C熱激溫度下不同熱激時間的瞬時表達率; E: 45°C熱激1.5 min染色; F: 45°C熱激3 min染色。*和**分別表示在≤ 0.05和≤ 0.01水平上顯著差異。

A:transient expression rate at different temperatures of 3 min; B:staining under CK (25°C); C:staining at 45°C heat shock; D:transient expression rate at different time under 45°C heat shock; E: 45°C heat shock 1.5 minstaining; F: 45°C heat shock 3 minstaining. * and ** indicates a significant difference at≤ 0.05 and≤ 0.01 levels, respectively.

2.4 谷子轉基因T0代陽性植株的獲得和檢測

冀谷11谷子幼穗小段經15 d誘導, 共得到有效愈傷組織3120塊, 農桿菌侵染轉化、篩選后得到513塊抗性愈傷組織, 抗性愈傷組織誘導率為16.4%?？剐杂鷤M織經分化、壯苗培養(yǎng)后獲得7棵抗性再生植株, 經煉苗后移栽溫室花盆生長(圖4-A~D)。提取PPT抗性植株的DNA, 進行基因的PCR分析, 結果表明, 7株植株中有6株為陽性植株, 陽性植株率約為85.7% (圖4-E), PCR檢測結果初步證明基因已經整合進谷子基因組中。陽性的轉化植株進一步做Southern雜交分析, 由圖4-F可看出, 未轉化植株未顯示任何雜交信號, 而檢測的4個轉化植株中都顯示了有基因的雜交信號, 證明該基因已經整合進谷子基因組中, 同時也證明了經農桿菌轉化的外源基因拷貝數低的優(yōu)點。

圖4 T0代轉基因植株鑒定

A: 愈傷組織分化; B: 再生植株; C: 壯苗; D: 再生植株移栽; E:基因PCR檢測, 1~7為T0代轉化單株; F: T0代轉化株Southern blot, 1~5: 經I酶切, 7~11: 經d III酶切, 6: 野生型。M: marker DL2000; H: 水對照; WT: 野生型; P: 質粒。

A: calli differentiation; B: regenerated plant; C: strong seedling; D: transplanting of regenerated plants; E: bar PCR detection, 1–7 are T0generation transformed plants; F: Southern blot of T0generation of transgenic lines, 1–5: digested withI, 7–11: digested withind III, 6: wild type. M: marker DL2000; H: water control; WT: wild type; P: plasmid.

2.5 谷子轉基因植株抗PPT除草劑鑒定和遺傳分析

播種T0代轉基因陽性植株, 獲得T1代轉基因植株, 待植株長至四葉期, 用常規(guī)PCR法及Bar蛋白抗體試紙法檢測T1陽性株, 經統計112棵T1代植株, 陽性株與陰性株的分離比符合3︰1, 證實該基因是單拷貝插入。隨后又對T3代轉基因植株葉片進行PPT抗性分析, 用棉棒將濃度為0、2.5、5.0 g L–1的PPT溶液涂抹未轉化植株葉片, 當PPT溶液濃度為2.5 g L–1以上時, 所有經過涂抹的谷子葉片均在1周內開始黃化, 脫水萎蔫, 直至枯死。而PCR檢測呈陽性的轉化植株經PPT溶液涂抹葉片后, 均表現出抗性, 結合Bar蛋白抗體試紙條結果確定了最適的PPT篩選濃度為2.5 g L–1(圖5)。該結果也證實了基因可以在谷子轉基因后代中穩(wěn)定表達。

3 討論

3.1 影響谷子組培特征及瞬時轉化效率的主要因素

影響谷子組織培養(yǎng)的因素較多, 而合適外植體誘導出的胚性愈傷組織是高效轉化率的基礎。柳琳[30]探究了不同生長狀態(tài)的谷子幼穗誘導出的愈傷組織狀態(tài), 發(fā)現枝梗分化期的谷子幼穗誘導的胚性愈傷組織率較高; 小穗分化期的谷子幼穗產生的胚性愈傷組織少, 多數變褐逐漸死亡; 小花分化期、雌雄蕊分化期和幼穗打包期的谷子幼穗誘導出的胚性愈傷組織極低。董云洲等[6]將處于小花分化期的幼穗在改良后的MS培養(yǎng)基上誘導20 d, 可分化的胚性愈傷組織獲得率僅為0.55%, 與本研究的結果趨勢相同。本試驗又對枝梗分化期的幼穗細分, 發(fā)現長度為0.5~1.0 cm的幼穗胚性愈傷組織誘導效率最高, 可達到92.74%。

圖5 T3代轉基因株bar基因抗性試驗

A: 2.5 g L–1PPT溶液涂抹葉片; B: 2.5 g L–1PPT 溶液噴灑葉片, 左側轉化株, 右側未轉化株; C: Bar蛋白抗體試紙條鑒定結果。 CK: 未轉化陰性對照; Vegative: 轉基因陰性株; Positive: 轉基因陽性株。

A: 2.5 g L–1PPT solution coated leaves; B: 2.5 g L–1PPT solution sprayed leaves in transgenic lines (left) and in CK (right); C: Bar protein test results. CK: wild type control; Negative: negative transgenic lines; Positive: positive transgenic line.

本研究表明, 熱激對農桿菌介導的谷子愈傷組織瞬時遺傳轉化效率的提高有顯著作用。結合Hiei等[31]的試驗結果, 農桿菌介導的侵染受體的遺傳轉化效率的提高需要一定的溫度條件, 在受體材料存活所需的其他條件都可以滿足的情況下, 在一定的溫度范圍內, 溫度和遺傳轉化效率正相關, 并且要積累到一定的溫度總量。徐游[32]采用42°C 3 min和38°C 5 min的處理方式處理玉米幼胚,染色結果表明, 瞬時轉化效率分別提高9.43%和8.80%, 也證實了熱激溫度高, 需要的熱激時間短, 熱激溫度低, 需要的熱激時間長的推論。本試驗中45°C 3 min的熱激處理就可以顯著提高谷子愈傷組織瞬時轉化效率, 而37°C 3 min的熱激時間未能提高轉化效率, 延長37°C下的熱激時間是否可以提高愈傷組織的瞬時轉化效率需要進一步的試驗驗證。

3.2 谷子愈傷組織穩(wěn)定遺傳轉化效率需進一步提高

董云洲等[6]用基因槍法轟擊豫谷2號谷子幼穗,基因瞬時轉化效率為0.15%, 最終只獲得了0.05%的轉基因頻率。劉穎慧等[33]通過農桿菌介導法將帶有基因的pBI121載體轉化到谷子愈傷組織中, 經50 mg L–1卡那霉素篩選得到了轉基因陽性株, 但轉基因株后代不育。Lambe等[34]在谷子轉化過程中使用潮霉素作為選擇標記, 結果不能形成再生植株, 隨后又選用潮霉素B作為選擇標記, 獲得了可再生植株。Martins等[12]利用農桿菌介導法進行青狗尾草的轉化, 成功將其遺傳轉化效率提高到了29%。Martins等[13]和Saha等[14]通過蘸花法浸染孕穗期的青狗尾草, 轉化效率可達到0.6%~0.8%。本研究中, 我們將基因轉化谷子并成功獲得了轉基因植株, 通過分析驗證, 表明該基因已經整合到谷子基因組中, 且在后代中表現單基因分離。利用優(yōu)化后的方法開展谷子遺傳轉化, 穩(wěn)定的遺傳轉化效率可達到1.2%~1.5%, 較前人的研究有顯著提升, 但與模式作物水稻的遺傳轉化效率相比仍然存在較大差距。農桿菌介導的谷子遺傳轉化體系是多因素綜合效應, 不同的方法對轉基因效率影響不同, 其原因有待進一步探討, 谷子瞬時轉化效率高, 但是難以高效率整合到基因組中, 是我們后續(xù)待解決的問題。

3.3 抗除草劑轉基因谷子培育對生產實踐的意義

利用或者培育抗除草劑品種是目前控制作物田間雜草的重要措施之一, 也是提高作物產量、減少農藥施用量、保護環(huán)境的重要舉措。育種工作者用抗拿捕凈谷子材料“WRl”與綜合性狀優(yōu)良的常規(guī)谷子品種雜交, 在雜種自交后代中選育分離的抗除草劑單株, 已獲得性狀優(yōu)良的抗除草劑品種[24]。但是, 若同時篩選多個不同抗性品種或一個抗多種除草劑的品種, 工作量繁重, 耗時較長, 急需一種快速簡便的選育方法。目前, 在谷子中也克隆出抗除草劑基因, 如抗拿捕凈除草劑基因, 并開發(fā)了相應的分子標記[35], 由于除草劑拿撲凈對單子葉作物不具有選擇性, 目前在單子葉植物上的應用并不廣泛。草丁膦是農業(yè)生產中廣泛使用的高效低殘留除草劑,獲得草丁膦的抗性基因, 并通過基因工程手段在其他單子葉作物中表達, 將對農業(yè)生產具有重要意義。本研究通過優(yōu)化的遺傳轉化體系, 將外源抗草丁磷基因轉入谷子植株, 得到穩(wěn)定持久的谷子抗除草劑品系, 將該品系與其他品種配制雜交組合, 秧苗期噴草丁膦藥劑可有效清除田間雜草, 而不影響谷子的生長, 從而減輕人工除草的投入, 做到輕簡栽培。本研究對于豐富目前缺乏的抗除草劑谷子品種和提高谷子生產效率具有重要意義。

4 結論

本研究探討了幼穗大小、幼穗愈傷組織的誘導培養(yǎng)時間等對于愈傷組織狀態(tài)及再生的影響。并通過熱激處理的方式顯著提高了谷子瞬時遺傳轉化效率, 確定了谷子抗除草劑基因的篩選濃度。通過已建立的轉化體系獲得了穩(wěn)定遺傳的抗草丁膦除草劑的谷子轉基因材料。為以后谷子功能基因的驗證奠定了堅實的基礎, 并為谷子基因工程育種提供了良好的資源。

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Use ofGene for the Stable Transformation of Herbicide-resistant Foxtail Millet Plants

CHEN Qian-Nan1, 2, WANG Ke1, TANG Sha1, DU Li-Pu1, ZHI Hui1, JIA Guan-Qing1, ZHAO Bao-Hua2, YE Xing-Guo1, and DIAO Xian-Min1,*

1Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;2College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050024, Hebei, China

Efficiency ofgenetic transformation has been the main factor that restricts the study of functional genes and transgenic breeding in foxtail millet. In this study, foxtail millet variety Jigu 11 panicle primordia were used as explants. Young panicles of 0.5–1.0 cm in length were picked and cut into small pieces. The young embryos were cultured in modified MS medium for inducing embryogenic calli, totally forming 3120 embryogenic calli in 15–20 days. Soaking the calli in the infection suspension prior to transformation, and the heat treatment at 45°C for 3 min could effectively improve the transient genetic transformation efficiency by 26.1%. The transformed calli were screened with phosphinothricin (PPT), in which 513 were resistant calli, with the resistant calli rate of 16.4%. Seven herbicide-resistant plants were obtained after resistant calli differentiation and seedling culture. Six T0transgenic positive plants were identified by PCR and Southern blot. PPT resistance analysis was carried out on leaves in T3generation of transformed plants, and combined with Bar protein antibody test strip identification, the results confirmed that thegene stably incorporated into the genome of foxtail millet seedlings. This study established a stable genetic transformation system in foxtail millet, which is of great significance in improving the efficiency of molecular breeding, and prompting foxtail millet as a new model plants.

foxtail millet;; genetic transformation; heat shock; herbicide-resistant

2017-11-23;

2018-07-20;

2018-08-01.

10.3724/SP.J.1006.2018.01423

刁現民, E-mail: diaoxianmin@caas.cn

E-mail: qianying9201@163.com

本研究由國家自然科學基金項目(31501324, 31522040), 中國農業(yè)科學院基本科研業(yè)務費(Y2017JC15, CAAS-XTCX2016001-5, CAAS-XTCX2016002), 國家現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項(CARS-06-13.5-A04)和中國農業(yè)科學院創(chuàng)新工程雜糧團隊項目資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31501324, 31522040), the Fundamental Research Funds of CAAS (Y2017JC15, CAAS-XTCX2016001-5, CAAS-XTCX2016002), the China Agriculture Research System (CARS-06-13.5-A04), and the Agricultural Science and Technology Innovation Program of the Chinese Academy of Agricultural Sciences.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180731.1121.004.html