侯震，董蒨蒨，黃劍鋼，尹偉，范闊海，孫耀貴，李宏全

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是豬的一種病毒性急性傳染病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)所引起的[1]。目前，PRRS已經(jīng)嚴(yán)重影響了全世界的養(yǎng)豬業(yè)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前，主要通過接種疫苗來防治本病，但隨著不同毒株的出現(xiàn)，對(duì)PRRS的防控難度日益增加。天然產(chǎn)物在藥物研發(fā)過程中起著相當(dāng)重要的作用，市面上的大多數(shù)藥物都是直接或間接源自于天然產(chǎn)物。研究前期篩選出了多種具有抗病毒作用的天然化合物，例如苦參堿能夠抑制PRRSV[3]和PCV2[4]在細(xì)胞上的復(fù)制；丹參酮IIA磺酸鈉可以干擾PRRSV[5]和MDV[6-7]的增殖。

茶皂素是前期體外篩選抗PRRSV天然化合物時(shí)，篩選出來的一種從茶樹種子中提取出來的一類糖苷化合物。實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果已經(jīng)證實(shí)了茶皂素的體外抗PRRSV作用，并已證實(shí)茶皂素能顯著抑制PRRSV N蛋白的表達(dá)，從而影響病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制[8]。但茶皂素的抗PRRSV作用是否只局限在直接作用于病毒尚未報(bào)到。文獻(xiàn)報(bào)道清道夫受體CD163[9]和波形蛋白(Vimentin)[10]是PRRSV穿入Marc-145細(xì)胞的重要受體[11]。細(xì)胞受體可能是茶皂素抗病毒作用的靶點(diǎn)之一。此外，PRRSV可以通過內(nèi)源性線粒體通路引起細(xì)胞凋亡，凋亡亦可作為研究抗病毒機(jī)制方向之一[12]。

前期的細(xì)胞毒性試驗(yàn)和抗病毒試驗(yàn)，已經(jīng)證實(shí)茶皂素在Marc-145細(xì)胞上的最大安全濃度(maximum no-cytotoxic concentration，MNTC)為30 μg/mL，且在該濃度下，TS對(duì)PRRSV的復(fù)制有抑制作用[8]。因此，試驗(yàn)在此濃度下，從PRRSV感染細(xì)胞的受體入手，在mRNA和蛋白水平研究TS對(duì)感染PRRSV的Marc-145細(xì)胞上CD163和Vimentin兩種受體的表達(dá)量影響，并在蛋白水平上初步研究TS對(duì)感染PRRSV的Marc-145細(xì)胞中caspase-9活化的影響，以補(bǔ)充TS抗PRRSV的機(jī)制，為茶皂素的后續(xù)開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑 細(xì)胞級(jí)DMSO及DMEM高糖液體培養(yǎng)基購于美國(guó)Sigma公司；β-actin單克隆抗體、高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；caspase-9抗體購于美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；FITC標(biāo)記山羊抗鼠IgG購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)抗體購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；脫脂奶粉、兔抗CD163抗體購于武漢博士德生物工程有限公司；Vimentin多克隆抗體購于南京巴傲德生物科技有限公司；SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ及PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購于大連TaKaRa公司；蛋白提取試劑盒購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.2 藥品 試驗(yàn)所用藥物TS濃度為98%，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院雷海民教授惠贈(zèng)。陽性藥物利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：140629-200202)購于中國(guó)食品藥品檢定研究所。

1.3 細(xì)胞、病毒 Marc-145細(xì)胞購買于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。高致病性JXAJ-R株P(guān)RRSV活疫苗，購于廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司，其生產(chǎn)批號(hào)為1012001，毒力為10-6。

1.4 TS對(duì)CD163、Vimentin基因作用的測(cè)定

1.4.1 細(xì)胞總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)文獻(xiàn)[13]進(jìn)行樣品制備，分別設(shè)細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組(100TCID50)、30 μg/mL TS試驗(yàn)組、0.125 mg/mL利巴韋林對(duì)照組。在6孔板中，接種Marc-145細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右，與PRRSV(100TCID50)在4 ℃下共孵育2 h，棄掉病毒液。然后加入2% DMEM細(xì)胞生長(zhǎng)維持液，放入37 ℃培養(yǎng)箱中(從此時(shí)開始計(jì)時(shí)，即為穿入0 h)，2 h將2%DMEM細(xì)胞生長(zhǎng)維持液用藥液替換，并繼續(xù)放入37 ℃培養(yǎng)箱中，到穿入5 h時(shí)，將TS試驗(yàn)組和利巴韋林對(duì)照組培養(yǎng)液換為2%DMEM細(xì)胞生長(zhǎng)維持液，仍放入37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h。使用TRIzol?Reagent試劑盒，進(jìn)行RNA樣品的提取。根據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行cDNA合成，普通PCR擴(kuò)增。

1.4.2 qRT-PCR反應(yīng)檢測(cè)CD163和Vimentin mRNA基因的表達(dá)量 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中猴屬CD163、Vimentin和18S基因核酸CDS區(qū)序列，運(yùn)用Primer3 Plus軟件設(shè)計(jì)出以下3對(duì)引物見表1，由華大基因公司合成。

表1 引物序列及PCR產(chǎn)物大小Tab 1 Primer sequences and the size of PCR products

以cDNA為模板，加入各檢測(cè)基因的對(duì)應(yīng)引物，進(jìn)行SYBP Green RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件依次為：90 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，退火溫度56 ℃，退火30 s，整個(gè)過程設(shè)40個(gè)循環(huán)數(shù)。以18sRNA作為內(nèi)參，所得數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法對(duì)目的基因的表達(dá)量進(jìn)行比較分析。

1.5 TS對(duì)CD163和Vimentin蛋白作用的測(cè)定 根據(jù)1.4.1項(xiàng)樣品，使用蛋白提取試劑盒提取蛋白。使用NanoDrop核酸蛋白分析儀進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。分別以兔抗CD163單克隆抗體、兔抗Vimentin(I444)單克隆抗體和鼠抗β-actin單克隆抗體為一抗，山羊抗兔IgG(H+L)二抗(1∶10000)或山羊抗鼠IgG二抗(1∶5000)為二抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.6 TS對(duì)caspase-9蛋白活化作用的測(cè)定 設(shè)細(xì)胞對(duì)照組，病毒對(duì)照組(100TCID50)，TS對(duì)照組，30 μg/mL TS加毒試驗(yàn)組(先加100TCID50PRRSV 6 h，用PBS洗2遍，再加TS)，利巴韋林125 μg/mL加毒對(duì)照組，30 μg/mL TS加毒試驗(yàn)組(先加100TCID50PRRSV 12 h，用PBS洗2遍，再加TS)，在24 h后使用蛋白提取試劑盒提取蛋白，收集caspase-9蛋白樣品。使用NanoDrop核酸蛋白分析儀進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。分別以兔抗caspase-9單克隆抗體和鼠抗β-actin單克隆抗體為一抗，山羊抗兔IgG(H+L)二抗(1∶10000)或山羊抗鼠IgG二抗(1∶5000)為二抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.7 數(shù)據(jù)分析 本試驗(yàn)均通過(GraphPad Software，Inc.California，USA)軟件計(jì)算處理而得到所有相關(guān)數(shù)據(jù)以及方差分析，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，且每次試驗(yàn)設(shè)有4個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TS對(duì)CD163和Vimentin基因表達(dá)量的測(cè)定

如圖1所示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，病毒組CD163和Vimentin基因表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)；TS試驗(yàn)組及利巴韋林對(duì)照組CD163和Vimentin基因表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。與病毒組相比，TS試驗(yàn)組CD163和Vimentin基因表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；利巴韋林對(duì)照組CD163基因表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，而Vimentin基因表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)；與利巴韋林對(duì)照組相比，TS試驗(yàn)組CD163、Vimentin基因表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。

相同字母表示組與組之間差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示組與組間差異顯著(P<0.05)The same letters indicate no significant differences between groups(P>0.05), different letters show significant differences between groups(P<0.05)圖1 CD163和Vimentin各組基因的表達(dá)量Fig 1 The mRNA expression of CD163 and Vimentinin in each group

2.2 TS對(duì)CD163 和Vimentin 蛋白合成的影響 以β-actin作為內(nèi)參蛋白，采用Image Pro Plus軟件對(duì)各組蛋白條帶灰度值進(jìn)行定量分析。結(jié)果如圖2所示，TS試驗(yàn)組CD163、Vimentin蛋白表達(dá)量均顯著少于細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組(P<0.05)，細(xì)胞對(duì)照組與病毒對(duì)照組兩種蛋白的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)，利巴韋林對(duì)照組兩種蛋白的表達(dá)量高于TS試驗(yàn)組，但差異不顯著(P>0.05)。

相同字母表示組與組之間差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示組與組之間差異顯著(P<0.05)The same letters indicate no significant differences between groups(P>0.05), different letters show significant differences between groups(P<0.05)圖2 CD163和Vimentin各組蛋白的表達(dá)量Fig 2 The expression of CD163 and Vimentinin in each group

2.3 TS對(duì)caspase-9蛋白活化的影響 本試驗(yàn)采用western blot對(duì)各組caspase-9的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，結(jié)果如圖3所示。正常細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組、TS對(duì)照組以及利巴韋林對(duì)照組在細(xì)胞培養(yǎng)24 h時(shí)，均不出現(xiàn)caspase-9的活化；先加毒6 h和12 h再加TS的兩個(gè)試驗(yàn)組均能檢測(cè)到明顯的caspase-9活化片段；六個(gè)組均能檢測(cè)到以酶原形式存在的caspase-9。

圖3 24h caspase-9蛋白的表達(dá)Fig 3 The expression of caspase-9 protein at 24h

3 討論與結(jié)論

3.1 TS對(duì)細(xì)胞受體CD163和Vimentin的基因合成和蛋白表達(dá)的影響 PRRSV進(jìn)入Marc-145細(xì)胞過程中CD163和Vimentin具有重要作用[13]。據(jù)研究報(bào)道證實(shí)，細(xì)胞受體CD163在PRRSV侵入與復(fù)制的過程中起著一定作用[2,14-15]。Kim等[10]于2006年報(bào)道證實(shí)Marc-145細(xì)胞受體Vimentin可以與PRRSV中的N蛋白相互作用介導(dǎo)病毒侵入。目前，常見的抑制PRRSV增殖的報(bào)道都是以細(xì)胞受體PCBP1和PCBP2為靶點(diǎn)進(jìn)行抗PRRSV研究[16-17]，TS能否抑制感染PRRSV細(xì)胞的CD163和Vimentin表達(dá)，可以作為研究其抗病毒活性的途徑之一。試驗(yàn)選擇以CD163和Vimentin兩種Marc-145細(xì)胞受體為靶點(diǎn)進(jìn)行抗PRRSV侵入機(jī)制的研究。從qRT-PCR與Western blot結(jié)果來看，TS可顯著抑制感染PRRSV的Marc-145細(xì)胞受體CD163和Vimentin mRNA和蛋白水平的表達(dá)。推測(cè)TS可通過抑制PRRSV入侵細(xì)胞的過程來發(fā)揮其抗PRRSV作用。

3.2 TS對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性凋亡通路啟動(dòng)子caspase-9活化的影響 藥物能夠通過促進(jìn)病毒感染早期宿主細(xì)胞的凋亡或者抑制病毒感染晚期細(xì)胞的凋亡，是凋亡的一種抗病毒機(jī)制[18]。然而，目前針對(duì)抗PRRSV凋亡機(jī)制的研究并未有報(bào)道。中藥抗病毒凋亡通路機(jī)制可以選用caspase-8、caspase-9、caspase-3的活化作為檢測(cè)指標(biāo)[19-21]。在本實(shí)驗(yàn)室課題組前期的研究中，已證實(shí)在PRRSV感染Marc-145細(xì)胞24 h時(shí)檢測(cè)不到活化的caspase-3，而在第48 h和60 h均能檢測(cè)到活化的caspase-3片段[10]，因此推測(cè)病毒感染細(xì)胞24 h可能是感染細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期階段。Roy等[22]于2000年研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV能夠激活依賴caspase-9的細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑，即當(dāng)細(xì)胞受到死亡受體信號(hào)刺激時(shí)，通過一系列的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，激活caspase-9，最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞的凋亡。同樣，Sang-Myeong Lee[19]等于2007年研究證實(shí)，PRRSV體外感染Marc-145細(xì)胞，能夠引起細(xì)胞內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路的關(guān)鍵因子細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)釋放到細(xì)胞質(zhì)，使得Bax的表達(dá)上升。因而試驗(yàn)選擇caspase-9為靶點(diǎn)，進(jìn)行TS作用于PRRSV感染Marc-145細(xì)胞早期時(shí)caspase-9是否能夠活化的研究。Western blot 結(jié)果顯示，在PRRSV感染宿主細(xì)胞24 h時(shí)，細(xì)胞自身、病毒感染的細(xì)胞、陽性藥物利巴韋林與病毒作用的細(xì)胞caspase-9均不出現(xiàn)活化，而在TS作用于病毒感染細(xì)胞的兩個(gè)試驗(yàn)組中，TS明顯促進(jìn)了內(nèi)源性凋亡信號(hào)caspase-9的活化，從而使細(xì)胞啟動(dòng)不可逆的凋亡過程。該結(jié)果表明，當(dāng)病毒完全侵入宿主細(xì)胞，在進(jìn)入復(fù)制階段，加入TS出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，表明TS有可能在病毒復(fù)制早期通過內(nèi)源性信號(hào)途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而起到了抗病毒作用，這為TS抗病毒機(jī)制研究提供了一條新的思路。TS可通過抑制CD163和Vimentin的表達(dá)，進(jìn)而抑制PRRSV在Marc-145細(xì)胞上的侵入過程，從而達(dá)到抗PRRSV的作用；亦可通過激活細(xì)胞凋亡內(nèi)源性通路以早期促進(jìn)細(xì)胞凋亡的方式，進(jìn)而抑制PRRSV的復(fù)制，發(fā)揮其抗PRRSV的作用。