彭麗 ，吳寧鵬，方忠意，舒暢，杜紅鴿，朱雷

(河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008)

我國是養(yǎng)蜂大國，蜂蜜產(chǎn)量和出口量均居世界第一[1]，隨著養(yǎng)蜂產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展，獸藥在防治蜂病、降低蜜蜂死亡率、提高蜂產(chǎn)品產(chǎn)量方面起到了重要作用。喹諾酮類藥物系化學(xué)合成藥物，由于價格低廉，具有廣譜、高效、低毒以及與其他抗菌藥物無交叉耐藥性等特點(diǎn)，在蜜蜂養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中，廣泛用于預(yù)防和治療可引起蜜蜂幼仔大量死亡的美國或歐盟污仔病。喹諾酮類藥物在其廣泛應(yīng)用的同時亦存在著不少問題，過量或不當(dāng)使用會導(dǎo)致藥物殘留，除其本身的毒副作用對人體造成直接危害外，更為嚴(yán)重的是人類長期食用含較低濃度喹諾酮類藥物的蜂產(chǎn)品，容易誘導(dǎo)耐藥性的傳遞，從而影響該類藥物的臨床療效。因此，蜂產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留問題越來越受到人們的重視。目前，蜂產(chǎn)品中喹諾酮類藥物的檢測方法主要有：薄層色譜法[2-3]、高效液相色譜法[4-7]和液質(zhì)聯(lián)用檢測法[8-15]等,其中液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)由于選擇性和靈敏度較高，應(yīng)用最為廣泛。由于蜂王漿樣品基質(zhì)非常復(fù)雜，目前的檢測方法多是僅針對蜂蜜樣品，涉及蜂王漿樣品的也多是采用QuEChERS方法[8-10]進(jìn)行凈化，檢測限較高，藥物種類較少，難以滿足實際樣品檢測的需要。本文采用固相萃取方法作為凈化方法，結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了同時測定蜂蜜和蜂王漿中20種喹諾酮類藥物殘留量的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters公司)；XP205分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)，SIGMA 3-30K離心機(jī)(德國SIGMA公司)；KQ-3200E超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；N-EVAP-112氮吹儀(美國Organomation)；MS3 basic渦旋混合器(IKA)。惡喹酸、氟甲喹、西諾沙星、二氟沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、培氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、萘啶酸、依諾沙星、達(dá)氟沙星、麻保沙星、氟羅沙星、加替沙星、奧比沙星、吡哌酸和司帕沙星標(biāo)準(zhǔn)品對照品，含量均大于91.1%，購于Dr. Ehrenstorfer公司；Waters Oasis HLB 固相萃取柱(6mL/500mg)；Whatman玻璃纖維濾紙(1.6 μm)。甲醇、乙腈、甲酸(色譜純)；氨水、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙酸乙酯(分析純)；實驗用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)制備的去離子水。提取液：稱取磷酸氫二鈉7.16 g和磷酸二氫鈉3.12 g，加入800 mL水溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0±0.5，再用水定容至1000 mL。20%乙腈甲酸溶液：取乙腈20 mL，用0.1%甲酸溶液定容至100 mL。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取喹諾酮類對照品各10 mg，分別于10 mL量瓶中，用少量氨水溶解后，用甲醇稀釋至刻度，配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。-20 ℃保存，有效期6個月。

1.3 樣品前處理

1.3.1 蜂蜜 稱取試料 (2±0.02) g，于50 mL聚丙烯離心管中。加提取液20 mL，渦旋1 min，振蕩10 min，10000 r/min離心5 min，取上清液，備用。

1.3.2 蜂王漿 稱取試料 (2±0.02) g，于50 mL聚丙烯離心管中。加提取液10 mL，渦旋1 min，振蕩10 min，10000 r/min離心5 min，取上清液。殘渣加提取液10 mL重復(fù)提取，合并兩次上清液，玻璃纖維濾紙過濾后，備用。

1.3.3 凈化 固相萃取柱分別用甲醇10 mL、水10 mL活化，取備用液過柱，用水5 mL淋洗，抽干，分別用5%甲酸甲醇4 mL和乙酸乙酯4 mL洗脫，收集洗脫液，于40 ℃氮?dú)獯蹈?。?0%乙腈甲酸溶液1.0 mL溶解殘余物，超聲1 min后渦旋混勻，20000 r/min離心5 min，上清液濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜參考條件 色譜柱：Waters UPLCTMBEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流速0.30 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流動相A相為甲醇，B相為0.1%甲酸溶液，梯度洗脫程序：0～1.5 min，5%～20%A；1.5～4.5 min，20%～40%A；4.5～6.5 min，40 %～95%A；6.5～7.5 min，95%A；7.5～8.0，95%～5%A；8.0～9.0 min，5%A。

1.4.2 質(zhì)譜參考條件 離子源：電噴霧離子源；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；電離電壓1.0 kV；源溫150 ℃；霧化溫度500 ℃；錐孔氣流速150 L/h；霧化氣流速1000 L/h；定性離子對、定量離子對及對應(yīng)的碰撞能量參考值見表1。

表1 20種喹諾酮類藥物的分子式、保留時間和質(zhì)譜參數(shù)Tab 1 Molecular formula, retention time and MS parameters of 20 quinolones

*定量離子

1.5 定性測定 在同樣測試條件下，試樣液中喹諾酮類藥物的保留時間與基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中喹諾酮類藥物的保留時間之比，偏差在±2.5%以內(nèi)，且檢測到的離子的相對豐度，應(yīng)當(dāng)與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液相對豐度一致，其允許偏差應(yīng)不大于±30%。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍 精密量取喹諾酮類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用20%乙腈甲酸溶液稀釋，配制成濃度為1、2、5、10、20、50 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取1.0 mL，分別于6個經(jīng)提取、凈化吹干步驟處理的空白試料中，溶解殘余物，20000 r/min離心5 min，上清液過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。蜂蜜和蜂王漿基質(zhì)中各藥物的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表2。從表中可以看出，藥物在1～50 ng/mL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)，喹諾酮類藥物蜂王漿基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子色譜圖如圖1所示。

2.2 方法的靈敏度 添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于2 g空白樣品中，經(jīng)提取后測定，依據(jù)信噪比S/N>3(按PtP算)，確定檢出限為0.5 μg/kg。依據(jù)信噪比S/N>10(按PtP算)，確定定量限為1.0 μg/kg。

2.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度考察 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白蜂蜜、蜂王漿中添加1.0、2.0、5.0 μg/kg 3個不同濃度，進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度試驗，各濃度進(jìn)行5個樣品平行試驗，重復(fù)3次，求批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，計算結(jié)果見表2。從表中可以看出，本方法在空白蜂蜜和蜂王漿中進(jìn)行1～5 μg/kg的添加，平均回收率在69.0%～105.1%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于14.7%。說明該方法對蜂蜜和蜂王漿中喹諾酮類藥物不同含量的測定均有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

表2 20種藥物的相關(guān)系數(shù)、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab 2 Correlation coefficients, recovers and RSDs of 20 quinolones in bee products

添加濃度單位為μg/kg

3 討論與結(jié)論

3.1 儀器條件的優(yōu)化 將一定濃度的喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)溶液流動注射進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)這些藥物的[M+H]+峰均比較強(qiáng)，故選擇[M+H]+作為母離子。喹諾酮類藥物因分子中含有羧基和哌嗪結(jié)構(gòu)，子離子主要為脫羧峰[M+H-CO2]+和脫羧后哌嗪環(huán)斷裂重排[M+H-CO2-C2H4NR ]+。選擇豐度最強(qiáng)的碎片離子作為定量離子，次強(qiáng)的碎片離子作為定性離子。由于喹諾酮類藥物均為兩性物質(zhì)，色譜峰易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。采用0.1%甲酸水溶液作為流動相的組成部分，可以增加化合物的離子化效率，使檢測的靈敏度迅速提高，并且20種藥物均能得到對稱、尖銳的峰形。

3.2 凈化條件的確定 喹諾酮類藥物中含有羧基和叔氨基，具有酸堿兩性性質(zhì)，參考文獻(xiàn)及藥物性質(zhì)，用標(biāo)準(zhǔn)溶液對Waters HLB柱[11、14]、Agilent C18柱、混合型陰離子交換柱[12](Agilent PAX柱)、混合型陽離子交換柱(Waters MCX柱、Agela PCX柱)和強(qiáng)陽離子交換柱(Supelco SCX)進(jìn)行考察。結(jié)果顯示C18柱和HLB柱對所有藥物都有很好的保留，回收率均在85%以上。PAX柱除了惡喹酸、諾氟沙星和依諾沙星回收率約為75%，其余藥物回收率均超過85%。陽離子交換柱結(jié)果均不理想，原因可能是陽離子交換柱對部分藥物的吸附作用太強(qiáng)。對蜂蜜和蜂王漿基質(zhì)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)二者差異較大。蜂王漿由于成分極為復(fù)雜，采用PAX柱進(jìn)行凈化時，藥物在固相萃取柱上的損失很大，方法回收率達(dá)不到30%，可能是蜂王漿中的王漿酸等酸性物質(zhì)在陰離子交換柱上的競爭結(jié)合導(dǎo)致。C18柱上大部分藥物有很好的回收，但恩諾沙星、吡哌酸回收率不到60%，相比之下HLB柱擁有更高更穩(wěn)定的回收率。最終選擇HLB柱作為凈化柱。

1-洛美沙星(352.11 > 265.06)；2-培氟沙星(334.12 > 290.10)；3-環(huán)丙沙星(332.10 > 231.01)；4-依諾沙星(321.16 > 303.10);5-諾氟沙星(320.10 > 233.04)；6-吡哌酸(303.97 > 189.05)；7-西諾沙星(263.03> 188.98)； 8-氟甲喹(262.05 > 202.00)；9-惡喹酸(262.03 > 159.98)；10-萘啶酸(233.05 > 214.98)；11-二氟沙星(400.11> 356.07)；12-奧比沙星(396.18 > 352.13)；13-司帕沙星(393.01 > 349.08)；14-沙拉沙星(386.09 > 299.02)15-加替沙星(376.19 > 261.10)；16-氟羅沙星(370.16 > 326.16)；17-馬波沙星(363.17 > 72.05)； 18-氧氟沙星(362.11 > 261.07)；19-恩諾沙星(360.13 > 316.10)；20-達(dá)氟沙星(358.18 > 340.13)圖1 喹諾酮類藥物蜂王漿基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子色譜圖(2 ng/mL)Fig 1 Chromatogram of quinolones in matrix standard (2 ng/mL)

3.3 提取條件的確定 提取溶液不僅影響藥物的提取效率，同時也會對藥物在固相萃取柱上的保留產(chǎn)生影響。喹諾酮類藥物中含有羧基和叔氨基，具有酸堿兩性性質(zhì)，易溶于酸性和堿性溶液。比較了pH分別為1、3、6和10的溶液作為提取液時的回收率，發(fā)現(xiàn)喹諾酮類藥物采用pH=3的溶液回收率最高。由于蜂王漿樣品只能部分溶于提取液，形成懸濁液，僅進(jìn)行一次提取部分藥物回收率不理想。經(jīng)過考察，最終采用20 mL分兩次對蜂王漿進(jìn)行提取。提取液高速離心后依然渾濁，需要采用玻璃纖維濾紙過濾后才能過固相萃取柱凈化。

該方法具有較好的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，適用于蜂產(chǎn)品中20種喹諾酮類藥物的殘留量的測定。