趙振理，暢繼武，孫 光，胡少華

(1.海南省婦幼保健院泌尿外科，海南 海口 571199；2.天津市泌尿外科研究所腫瘤免疫研究所，天津 300202)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，基因水平的研究提示膀胱癌的發(fā)生發(fā)展可能與基因的異常表達(dá)有關(guān)。研究者從基因水平對(duì)膀胱癌進(jìn)行研究，在膀胱癌組織中發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶P1(glutathione S-transferase pi-1,GSTP1)的一個(gè)特異性突變體。GSTP1屬于谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)基因家族中的一種，在膀胱癌中有較高水平的表達(dá)，而在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的基因庫(kù)中尚未發(fā)現(xiàn)有該突變體，因此本文作者將其提交至NCBI獲取基因號(hào)：AY887902，蛋白號(hào)：AAX14401，并進(jìn)一步制備AAX14401抗體Anti-AY[1-2]。為了進(jìn)一步對(duì)AAX14401蛋白在膀胱癌中的作用進(jìn)行研究，本研究對(duì)AAX14401蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，闡明該突變體在膀胱癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，為膀胱癌患者早期積極干預(yù)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集2004—2005年天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科術(shù)后存檔蠟塊中膀胱移行細(xì)胞癌標(biāo)本75例。其中男性55例，女性20例；年齡43～79歲，中位年齡63.3歲。所有患者均有詳細(xì)的臨床資料，且術(shù)前均未進(jìn)行化療或放療，術(shù)后有明確的病理學(xué)診斷結(jié)果。采用世界衛(wèi)生組織(WHO)病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)：Ⅰ級(jí)11例，Ⅱ級(jí)48例，Ⅲ級(jí)16例。選取標(biāo)本時(shí)，從12例因良性前列腺增生(BPH)行開(kāi)放手術(shù)的患者中取正常膀胱黏膜作為對(duì)照組。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有實(shí)驗(yàn)研究均有患者知情同意授權(quán)。

1.2 主要試劑 GSTP1(一抗)、免疫組織化學(xué)試劑盒(SP)和DAB顯色試劑盒購(gòu)自上海長(zhǎng)島生物公司，Anti-AY(一抗)由上海午立公司協(xié)助制備。

1.3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程和染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 切取厚度約4 μm的石蠟包埋組織切片，常規(guī)脫蠟、水化、滅活內(nèi)源性酶活性，熱抗原修復(fù)后，按照免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明劑封片。GSTP1陽(yáng)性染色為胞質(zhì)著色，呈淺黃至棕黃色顆粒，根據(jù)胞質(zhì)的染色程度分為：細(xì)胞質(zhì)未染色(-)，細(xì)胞質(zhì)呈淺黃色(+)，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色()。AAX14401蛋白陽(yáng)性染色為胞質(zhì)和胞核著色，呈淺黃至棕黃色顆粒。根據(jù)胞質(zhì)的染色程度分為：胞質(zhì)和胞核不著色(-)，胞質(zhì)和胞核呈淺黃色(+)，胞質(zhì)和胞核呈棕黃色()。所有閱片均由病理科2位主任醫(yī)師獨(dú)立完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。GSTP1和AAX14401蛋白在正常膀胱組織和膀胱癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率以及在膀胱癌不同分級(jí)間陽(yáng)性表達(dá)率的比較均采用秩和檢驗(yàn)；GSTP1和AAX14401蛋白在膀胱癌組織中表達(dá)情況的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同組織中GSTP1免疫組織化學(xué)染色 膀胱癌組織GSTP1染色結(jié)果呈陰性、染色程度“+”和“”者可見(jiàn)胞質(zhì)染成棕黃色(圖1A～C，見(jiàn)插頁(yè)五)；正常膀胱組織GSTP1染色呈陰性、染色程度“+”者可見(jiàn)胞質(zhì)染成淺黃色(圖1D和E，見(jiàn)插頁(yè)五)。

2.2 不同組織中AAX14401蛋白免疫組織化學(xué)染色 膀胱癌組織AAX14401蛋白染色結(jié)果呈陰性、染色程度“+”和“”者可見(jiàn)胞質(zhì)和胞核均有棕黃色著色(圖2A～C，見(jiàn)插頁(yè)五)；正常膀胱組織AAX14401蛋白染色結(jié)果均呈陰性(圖2D，見(jiàn)插頁(yè)五)。

2.3 GSTP1和AAX14401蛋白在膀胱癌組織中表達(dá)情況 在膀胱癌組織中，GSTP1和AAX14401蛋白并無(wú)同為陽(yáng)性表達(dá)者。膀胱癌組織中，GSTP1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為90.7%，而AAX14401蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為2.7%。見(jiàn)表1。

表1 GSTP1和AAX14401蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)

Tab.1 Expressions of GSTP1 and AAX14401 proteins in bladder cancer tissue

Expression of GSTP1Expression of AAX14401 -+Total-5117+160016520052Total731175

2.4 GSTP1和AAX14401蛋白在正常膀胱組織中的表達(dá)情況 GSTP1在正常膀胱組織中陽(yáng)性表達(dá)率為58.3%(7/12)，而AAX14401蛋白在正常膀胱組織中均未表達(dá)。

2.5 膀胱癌組織和正常膀胱組織中GSTP1和AAX14401蛋白表達(dá)情況 秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示：GSTP1在膀胱癌組織和正常膀胱組織中陽(yáng)性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其在低級(jí)別(病理分級(jí)為Ⅰ和Ⅱ級(jí))膀胱癌組織中表達(dá)水平和病理分級(jí)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.735,P<0.01)，但其在Ⅲ級(jí)膀胱癌組織中表達(dá)水平下降，推測(cè)可能是GSTP1出現(xiàn)了失活或突變。AAX14401蛋白在膀胱癌組織和正常膀胱組織中陽(yáng)性表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.596)。

2.6 膀胱癌組織中GSTP1和AAX14401蛋白表達(dá)的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示：GSTP1和AAX14401蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.274，P=0.018)。

3 討 論

膀胱癌作為泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)逐年升高[3]，但具體發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚。隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，學(xué)者開(kāi)始從基因水平對(duì)膀胱癌進(jìn)行研究。為了從基因水平對(duì)膀胱癌進(jìn)行研究，本課題組前期通過(guò)對(duì)正常膀胱組織與膀胱移行細(xì)胞癌組織進(jìn)行抑制消減雜交文庫(kù)的構(gòu)建，獲取了一條特異性的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)片段。對(duì)該EST片段進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增及生物信息學(xué)分析，提交至NCBI獲取基因號(hào)(AY887902)和蛋白號(hào)(AAX14401)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)AY887902是GSTP1的突變體[2]。

GSTP1屬于GSTs基因家族中的一種，主要在人類組織中表達(dá)。GSTs的表達(dá)水平與腫瘤的耐藥性有密切關(guān)系，作為在腫瘤細(xì)胞中最常見(jiàn)表達(dá)的GSTP1，可見(jiàn)于大多數(shù)的耐藥細(xì)胞中。相關(guān)研究[4-5]證實(shí)：GSTP1的表達(dá)異常升高會(huì)使腫瘤對(duì)順鉑等治療藥物有較強(qiáng)的解毒能力，從而表現(xiàn)出對(duì)藥物的耐受性。

GSTP1在膀胱癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌等組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于相應(yīng)的正常組織，并且腫瘤惡性程度越高，GSTP1表達(dá)水平越強(qiáng)[6-10]。有學(xué)者通過(guò)研究GSTP1在膀胱癌中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)GSTP1在膀胱癌中有較高水平的表達(dá)，并且其表達(dá)水平隨著膀胱癌病理分級(jí)的升高而增強(qiáng)，提示GSTP1可能與癌細(xì)胞的凋亡機(jī)制相關(guān)[11-14]。本研究對(duì)不同病理分級(jí)的膀胱癌組織GSTP1表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果顯示：GSTP1在低級(jí)別(病理分級(jí)為Ⅰ和Ⅱ級(jí))膀胱癌組織中表達(dá)水平與病理分級(jí)呈正相關(guān)關(guān)系，在Ⅲ級(jí)膀胱癌組織中表達(dá)水平下降，這與Pljesa-Ercegovac等[14]的研究結(jié)果有所差異。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床實(shí)踐相吻合，即腫瘤惡性度越高，對(duì)化療藥物的敏感性越強(qiáng)[15-16]。

Gao等[17]研究發(fā)現(xiàn)：GSTP1可以抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，提示GSTP1可能是一種抑癌基因。本研究對(duì)正常膀胱組織和膀胱癌組織GSTP1和AAX14401蛋白的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：GSTP1基因出現(xiàn)突變，并形成AY887902；而AY887902是失功能的突變體，并且僅存在于膀胱癌組織中。因此本文作者推測(cè)GSTP1突變失活后導(dǎo)致了膀胱癌的惡化。Berendsen等[18]對(duì)膀胱癌組織、癌旁正常組織和正常膀胱組織中GSTP1蛋白表達(dá)情況進(jìn)行分析結(jié)果顯示：膀胱癌的發(fā)生可能與GST/GSH系統(tǒng)的活性較低有關(guān)。因此本文作者認(rèn)為：本實(shí)驗(yàn)中病理分級(jí)Ⅲ級(jí)的膀胱癌組織中GSTP1蛋白表達(dá)水平較低，可能與GSTP1的失活或突變有關(guān)。

綜上所述，AAX14401蛋白的出現(xiàn)可能是膀胱癌惡化的一個(gè)標(biāo)志，因此提示如果能夠早期在膀胱癌組織中發(fā)現(xiàn)AAX14401蛋白，則可以對(duì)膀胱癌患者采取更加積極的治療措施。