石華治， 王 娟，劉玉平， 彭秋菊，黃明泉,*， 劉英俏，黃 佳， 張 倩

(1.北京天利海香精香料有限公司， 北京 101200; 2.北京工商大學(xué) 北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100048; 3.北京味食源食品科技有限公司， 北京 101200)

潮汕牛肉丸是粵菜三大流派中東江菜的代表之一。潮汕牛肉丸獨(dú)特的制作工藝(洗肉、瀝干、絞肉、攪拌、混料、定型、瀝干等)使其具有獨(dú)特的香味[1]。風(fēng)味是食品的重要屬性之一，而牛肉丸在制作、存儲(chǔ)和運(yùn)輸過程中易發(fā)生風(fēng)味劣變。因此了解和明晰牛肉丸的風(fēng)味物質(zhì)，有利于完善牛肉丸品質(zhì)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)儲(chǔ)藏加工后牛肉丸的風(fēng)味保持和牛肉香精香料的生產(chǎn)有指導(dǎo)意義。

揮發(fā)性風(fēng)味化合物的提取方法有固相微萃取、攪拌棒吸附萃取、同時(shí)蒸餾萃取、溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)萃取等[2]。 SPME[3]是集樣品采樣、富集和進(jìn)樣為一體的頂空萃取方法，簡便、經(jīng)濟(jì)、效率高、無溶劑、實(shí)用性強(qiáng)，被廣泛應(yīng)用于揮發(fā)性物質(zhì)分析中。

本實(shí)驗(yàn)采用SPME結(jié)合GC-O-MS分析生牛肉丸和熟牛肉丸的香氣活性物質(zhì)，同時(shí)結(jié)合香氣活性值鑒定生牛肉丸和熟牛肉丸的關(guān)鍵性香氣活性化合物。旨為牛肉丸的生產(chǎn)加工、質(zhì)量控制及風(fēng)味評(píng)價(jià)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)樣品：萬壯牛肉丸(配料為牛肉、豬肉、淀粉、大蒜、花生、芝麻、食用植物油、香辛調(diào)味料、醬油、味精、白砂糖、食用鹽、三聚磷酸鈉、焦磷酸鈉、六偏磷酸鈉)，塑料袋包裝，規(guī)格500 g，廣東潮汕萬壯食品有限公司。

試劑：丙二酸二乙酯(內(nèi)標(biāo))、甲基烯丙基硫醚、二烯丙基硫醚、烯丙基甲基二硫醚、二烯丙基二硫醚、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、反-2-辛烯醛、苯乙醇、乙基麥芽酚、甲硫醇等標(biāo)準(zhǔn)品(均為色譜純，純度>95%)，百靈威科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

7890B-5977A型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；ODP3型嗅聞檢測(cè)器，德國Gerstel公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS (灰色)萃取纖維(2 cm)、手動(dòng)固相微萃取手柄，美國Supleco公司；DF-lO1S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司；T-403型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品前處理

1.3.1.1 肉丸樣品制備

生牛肉丸：取生牛肉丸一個(gè)，用攪拌機(jī)粉碎至稠狀沒有大塊顆粒。稱取(8.000±0.002) g至40 mL萃取小瓶中，加入內(nèi)標(biāo)丙二酸二乙酯20 μL(質(zhì)量濃度為159.97 μg/mL)，震蕩均勻。

熟牛肉丸：取生牛肉丸一個(gè)，放入盛有500 mL自來水的鍋中加熱至沸騰，繼續(xù)煮制12 min。取出煮熟的牛肉丸，待晾干至表面沒有滴狀水珠后用攪拌機(jī)粉碎。取樣步驟操作與生牛肉丸一致。

1.3.1.2 固相微萃取

將50/30 μm灰色萃取頭(碳分子篩/聚二乙烯苯/聚二甲基硅氧烷，DVB/CAR/PDMS)在250 ℃進(jìn)樣口老化30 min。然后將準(zhǔn)備好的樣品瓶放置在45 ℃水浴鍋中平衡20 min，插入老化好的萃取頭萃取40 min，拔出萃取頭插入到氣質(zhì)聯(lián)機(jī)的進(jìn)樣口，在250 ℃下解析5 min[4]。

1.3.1.3 儀器分析條件

氣相色譜條件：DB-WAX (30.0 m×250 mm×0.25 μm) 極性色譜柱；升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?0 ℃，保持2 min，以8 ℃/min的速率升至80 ℃，再以4 ℃/min的速率升至100 ℃，最后以6 ℃/min的速率升至230 ℃，保持5 min；載氣(He，純度99.999%)流速1.0 mL/min，不分流。

質(zhì)譜條件：電子電離(EI)源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，掃描模式為Scan，掃描質(zhì)量范圍m/z為35～350u。

嗅覺檢測(cè)器條件：從色譜柱流出的餾分以1∶1的比例分別進(jìn)入嗅覺檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器，傳輸線的溫度為250 ℃，嗅聞口溫度220 ℃。

1.3.2定性分析

采用NIST14譜庫檢索匹配值，保留匹配度大于70的化合物并結(jié)合嗅聞和保留指數(shù)進(jìn)行定性。

嗅聞定性：結(jié)合NIST14譜庫檢索和化合物的香氣特征與對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比。

保留指數(shù)(retention index，RI)定性：通過公式(1)計(jì)算RI，并與文獻(xiàn)中報(bào)道的RI值做對(duì)比，取絕對(duì)值相差10以內(nèi)的化合物。

RI=100n+100×t-tntn+1-tn。

(1)

式(1)中,n和n+1分別為未知化合物流出前后正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)；t為未知化合物保留時(shí)間；tn和tn+1為相應(yīng)正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間(tn

1.3.3GC-O分析

香氣頻率法：對(duì)5位有GC-O 嗅聞經(jīng)驗(yàn)的嗅聞人員用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行嗅聞?dòng)?xùn)練。要求嗅聞人員在嗅聞過程中記錄香氣物質(zhì)出現(xiàn)的時(shí)間、香氣特征。嗅聞到化合物的次數(shù)即為該物質(zhì)的香氣頻率，記錄3位及以上評(píng)價(jià)人員所聞到的物質(zhì)。

1.3.4定量分析

采用內(nèi)標(biāo)法定量，通過樣品中各組分的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值和樣品中各組分濃度與內(nèi)標(biāo)濃度比值，求得各揮發(fā)性成分的含量。

1.3.5香氣活性值的計(jì)算

香氣活性化合物的OAV值計(jì)算見式(2)：

OAV=Ci/OTi。

(2)

式(2)中，Ci為化合物的質(zhì)量濃度，μg/kg；OTi為該化合物在水中的閾值，μg/kg。

2 結(jié)果與討論

2.1 牛肉丸揮發(fā)性成分分析

經(jīng)SPME-GC-O-MS分析牛肉丸煮制前后揮發(fā)性物質(zhì)，通過譜庫檢索、保留指數(shù)計(jì)算、嗅聞和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比進(jìn)行定性分析，所得結(jié)果見表1。

由表1可知，在煮制前后牛肉丸中共鑒定出化合物42種，其中生牛肉丸中鑒定出29種揮發(fā)性化合物，熟牛肉丸中鑒定出35種化合物。生牛肉丸揮發(fā)性成分包括醇類4種，醛類6種，含硫類9種，酚類2種，雜環(huán)類3種，烴類5種；熟牛肉丸化合物種文獻(xiàn)保留指數(shù)均來自NIST14譜庫，“-”表示未檢測(cè)到該化合物。

表1 牛肉丸煮制前后SPME-GC-O-MS分析結(jié)果

類更加多樣化，含有醇類3種，醛類6種，酮類1種，含硫類9種，酚類1種，雜環(huán)類4種，烴類8種，酯類2種，酸類1種。

含硫化合物主要來源于美拉德反應(yīng)或氨基酸熱解，具有非常小的閾值并且是牛肉中重要的風(fēng)味物質(zhì)[5]。在2種牛肉丸中共檢測(cè)到11種含硫化合物，包括烯丙硫醇、硫化丙烯、甲基烯丙基硫醚、二烯丙基硫醚、甲基烯丙基二硫醚、二烯丙基二硫醚、2-乙酰基噻唑、5-甲基-2-噻吩甲醛、2-乙烯基-1,3-二噻烷、3-烯丙基-1,2-二硫雜環(huán)己-5-烯、3-烯丙基-1,2-二硫雜環(huán)己-4-烯，其中甲基烯丙基硫醚、二烯丙基硫醚、2-乙?；邕虻然衔锒际桥Ｈ庵兄匾膿]發(fā)性物質(zhì)[6-8]。由表1可知，生牛肉丸中含硫物質(zhì)的質(zhì)量比遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他類物質(zhì)(1 123.24 μg/kg)，這與其他研究報(bào)道的生牛肉中的含硫物質(zhì)較少不同[9]。在煮制前后牛肉丸中都檢測(cè)到的3-烯丙基-1,2-二硫雜環(huán)己-5-烯和3-烯丙基-1,2-二硫雜環(huán)己-4-烯兩種化合物尚未在牛肉或豬肉相關(guān)的文獻(xiàn)中被報(bào)道，而孫穎等[10]、張娜等[11]研究表明它們是蒜和蒜薹的關(guān)鍵香氣成分；其次，2-乙酰基噻唑也存在于豬肉和芝麻中[12]。可見，牛肉丸制作時(shí)添加的輔料為牛肉丸貢獻(xiàn)了大量的含硫化合物。與生牛肉丸相比，熟牛肉丸中的含硫化合物種類增加，但總含量卻明顯減少。這是由于煮制過程中發(fā)生了硫胺素的降解和美拉德反應(yīng)，從而生成了新的含硫化合物，使其種類增加。同時(shí)，由于含硫化合物易揮發(fā)，在高溫煮制過程中損失，導(dǎo)致其含量在熟牛肉丸中降低。

醛類化合物是牛肉丸中重要的風(fēng)味物質(zhì)[13]，煮制前后的牛肉丸中共檢測(cè)到了戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、反-2-辛烯醛、苯甲醛7種化合物，但其在熟牛肉丸中質(zhì)量比較大(283.9μg/kg)，是生牛肉丸的1.22倍。醛類來源于脂質(zhì)氧化降解作用[14-15]，這些醛類化合物在加熱煮制過程中更易產(chǎn)生。醇通常由脂質(zhì)氧化生成的自由基促進(jìn)糖分解而產(chǎn)生[9]，在2種牛肉丸中都檢測(cè)到1-戊醇、正己醇、1-辛醇，且煮制后的牛肉丸醇類物質(zhì)含量明顯減少，這與Wang等[9]的結(jié)果一致，醇類物質(zhì)經(jīng)煮制后含量降低，可能是由于煮制后醇類物質(zhì)被氧化或發(fā)生酯化反應(yīng)生產(chǎn)其他物質(zhì)。

酯類、酸類、酮類物質(zhì)僅在熟牛肉丸中檢測(cè)到，這是由于牛肉丸中的脂類在煮制過程中受熱分解出的不飽和脂肪酸在加熱時(shí)發(fā)生氧化作用生成了酯類、酸類、酮類[7]。熟牛肉丸中檢測(cè)到的乙酸丁酯、苯甲酸甲酯、2,3-辛二酮和乙酸也是燉煮牛肉的重要揮發(fā)性物質(zhì)[13]。煮制前后的牛肉丸中都檢測(cè)到2-戊基呋喃、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪雜環(huán)化合物。2-戊基呋喃主要來源于亞油酸的氧化降解，2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪可由氨基酸Strecker降解產(chǎn)生[13]。這些也是牛肉丸輔料(醬油、芝麻)中重要的香氣成分[8,16]。熟牛肉丸中檢測(cè)到的吡嗪類化合物與生牛肉丸相比總含量沒有明顯變化，這是由于本實(shí)驗(yàn)是用水煮牛肉丸，煮制溫度不超過100 ℃，而吡嗪等雜環(huán)化合物易在高溫下形成。2-蒎烯、桉樹腦、檸檬烯等萜烯類化合物，一部分來源于牛肉丸中添加的香辛料[17]，另一部分可能由于吃了飼料后的牛，其牛肉本身含有這些成分[18]。

2.2 GC-O-MS香氣活性成分分析

通過GC-O-MS嗅聞對(duì)牛肉丸煮制前后的香氣活性成分進(jìn)行鑒定，并根據(jù)其OAV確定出牛肉丸煮制前后關(guān)鍵性香氣成分(見表2)。

由表2知，通過GC-O-MS分析，在煮制前后的牛肉丸中共鑒定出12種香氣活性物質(zhì)，包括呈芥末味、蔥香、蒜香的含硫化合物、呈青草香和脂肪香的醛類化合物以及甜香的苯乙醇和乙基麥芽酚。生牛肉丸中嗅聞到呈腐臭味的物質(zhì)，其在GC-O-MS的質(zhì)譜圖中沒有出峰，但卻能嗅聞到，根據(jù)其特征香并用標(biāo)準(zhǔn)品定性，確認(rèn)其為甲硫醇。這是由于甲硫醇在肉丸中含量較低，而其閾值較小的原因。

生牛肉丸中共鑒定出12種香氣活性物質(zhì)，OAV大于1的有9種。二烯丙基硫醚(OAV=201，蔥香)、二烯丙基二硫醚(OAV=109，芥末味)、甲基烯丙基硫醚(OAV=79，芥末味)、反式-2-辛烯醛(OAV=48，脂香)、己醛(OAV=35，青草香)、壬醛(OAV=35，油脂味)這6種物質(zhì)OAV最大，對(duì)生牛肉丸香氣有重要貢獻(xiàn)。這些物質(zhì)貢獻(xiàn)了芥末味、蒜香、蔥香、脂肪香、青草香和油脂味等，而據(jù)Byrne等[21]報(bào)道生牛肉具有非常微弱的血腥味，這表明制作過程中添加的輔料對(duì)牛肉丸的香氣有非常重要的影響，并使生牛肉丸的香氣更加豐富。熟牛肉丸中共鑒定出8種香氣物質(zhì)，OAV大于1的有8種。二烯丙基硫醚(OAV=631，蔥香)、己醛(OAV=42，青草香)、壬醛(OAV=33，油脂味)、二烯丙基二硫醚(OAV=31，芥末味)這4種化合物OAV最大，對(duì)熟牛肉丸香氣有重要貢獻(xiàn)作用。

表2 牛肉丸煮制前后GC-O-MS香氣活性物質(zhì)分析

“ * ”表示在生牛肉丸中聞到特征風(fēng)味，但GC-MS未檢測(cè)到； “-”表示該化合物在熟牛肉丸中未檢測(cè)到也未聞到該化合物的特征風(fēng)味。

有研究表明甲基烯丙基二硫醚、甲基烯丙基硫醚、二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚、甲硫醇是大蒜的重要風(fēng)味活性物質(zhì)，而甲基烯丙基硫醚、二烯丙基硫醚也是煮牛肉重要的風(fēng)味活性成分[22]。甲基烯丙基硫醚(芥末香)、二烯丙基硫醚(蔥香)在生、熟牛肉丸中的OAV較大，對(duì)生、熟牛肉丸的香氣都有重要貢獻(xiàn)。甲基烯丙基硫醚(芥末味)、甲基烯丙基二硫醚(蒜香)、二烯丙基二硫醚(芥末味)在生牛肉丸中的OAV較大，煮制后OAV變小。Shahidi等[23]研究表明在牛肉熱加工過程中含硫化合物含量會(huì)減少并維持在合理水平，避免含硫化合物在較高濃度時(shí)呈現(xiàn)出的惡臭味，可使牛肉整體香氣平衡。

侯莉等[13]的研究中表明己醛、庚醛、辛醛、壬醛、乙基麥芽酚是燉煮牛肉中的香氣活性物質(zhì)，這與本研究結(jié)果一致。己醛、庚醛、辛醛在熟牛肉丸中OAV變大，呈青草香、蔥香和油脂味，對(duì)煮牛肉丸的香氣貢獻(xiàn)顯著。這是由于牛肉丸在煮制過程中脂質(zhì)氧化成醛類，使其含量增加而OAV隨之變大[14-15]。反式-2-辛烯醛在生牛肉丸中OAV較大(48)而熟牛肉丸中未嗅聞到，可能因?yàn)榉词?2-辛烯醛是不飽和醛，在煮制過程中易被氧化或降解。

經(jīng)GC-O-MS嗅聞分析和OAV篩選，確認(rèn)出生牛肉丸關(guān)鍵香氣成分為二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚、甲基烯丙基硫醚、反式-2-辛烯醛、己醛、壬醛，而熟牛肉丸關(guān)鍵性香氣成分為二烯丙基硫醚、己醛、壬醛、二烯丙基二硫醚。二烯丙基硫醚、甲基烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚、甲基烯丙基二硫醚、反-2-辛烯醛、己醛等不僅在生牛肉丸和熟牛肉丸中都有較大的OAV，且經(jīng)過煮制后這些物質(zhì)的OAV有顯著變化，最終確認(rèn)這6種化合物是導(dǎo)致生牛肉丸煮制風(fēng)味變化的關(guān)鍵性香氣成分。

3 結(jié) 論

研究通過SPME-GC-O-MS對(duì)比分析了生牛肉丸和熟牛肉丸中的揮發(fā)性香氣成分，生牛肉丸中檢測(cè)到30種，而熟牛肉丸中檢測(cè)到35種。通過GC-O-MS篩選香氣活性物質(zhì)并比較其OAV變化，確定生牛肉丸的關(guān)鍵香氣活性物質(zhì)為二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚、甲基烯丙基硫醚、反式-2-辛烯醛己醛、壬醛，而熟牛肉丸中關(guān)鍵香氣活性物質(zhì)為二烯丙基硫醚、己醛、壬醛、二烯丙基二硫醚，其中二烯丙基硫醚、甲基烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚、甲基烯丙基二硫醚、反式-2-辛烯醛、己醛是導(dǎo)致生牛肉丸煮熟風(fēng)味變化的關(guān)鍵性香氣成分。

由于牛肉丸在制作過程中添加了大蒜、芝麻、醬油等輔料和香辛料，使得生牛肉丸中含硫化合物種類和含量較多，且貢獻(xiàn)蒜香、蔥香、脂香等香氣使得生牛肉丸香氣比生牛肉豐富；而牛肉丸煮制時(shí)發(fā)生了硫胺素的降解、美拉德反應(yīng)以及脂質(zhì)氧化等造成其酯類、酸類、酮類、醛類化合物種類和含量增加，含硫化合物含量減少，芥末味和蒜香貢獻(xiàn)減小，使得熟牛肉丸香氣更加柔和。

本實(shí)驗(yàn)通過原材料和煮制工藝對(duì)比分析了潮汕牛肉丸煮制前后關(guān)鍵性香氣成分及其差異，對(duì)牛肉丸的制作、運(yùn)輸和冷藏過程中的品質(zhì)控制具有一定的參考價(jià)值；而對(duì)于煮制前后潮汕牛肉丸關(guān)鍵性香氣成分與輔料添加的具體關(guān)系還需進(jìn)一步研究，從而為牛肉丸的品質(zhì)升級(jí)和產(chǎn)品開發(fā)提供指導(dǎo)。