張改娜， 史國(guó)安， 侯典云

(河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南洛陽 471023

秦艽(GentianamacrophyllaPall.)為龍膽科龍膽屬多年生草本植物，是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥和國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的野生藥材之一[1]，主產(chǎn)于陜西、甘肅、四川、內(nèi)蒙古等地。秦艽以其干燥根入藥，其味辛、苦、平，有祛風(fēng)濕、清濕熱、止痹痛之功效[2]，其主要有效成分為龍膽苦苷(gentiopicro side)，具有良好的保肝、健胃、利膽、抗炎、抗菌等作用[3-7]。近年來，由于秦艽的需求量猛增，使其被過度采挖，致使野生秦艽資源處于瀕危狀態(tài)，秦艽雖有栽培品種，但也因產(chǎn)量有限而使得近年來的價(jià)格不斷上漲。組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)在藥用植物上得以廣泛應(yīng)用，并已成為保護(hù)瀕臨滅絕的野生藥用資源和生產(chǎn)替代品的關(guān)鍵手段。原生質(zhì)體培養(yǎng)導(dǎo)致基因水平的變異是普遍的現(xiàn)象[8]，這種變異為植物育種提供了新的途徑[9]。

制備原生質(zhì)體常用的植物材料一般有葉片、子葉、下胚軸及愈傷組織等[10-12]。本研究對(duì)秦艽愈傷組織誘導(dǎo)和原生質(zhì)體培養(yǎng)及再生進(jìn)行了試驗(yàn)，以期獲得性狀優(yōu)良的愈傷組織，同時(shí)研究原生質(zhì)體分離和再生的條件，為進(jìn)一步開展秦艽大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)及秦艽的品質(zhì)改良工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

秦艽種子，采集于陜西省隴縣的秦艽種植基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的處理 將于4 ℃保存2周的秦艽種子用75%乙醇處理30 s，再用0.1%氯化汞處理6 min，最后用無菌水沖洗5遍，接種到1/2MS固體培養(yǎng)基上萌發(fā)。取無菌幼苗的嫩葉用來誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基為MS固體培養(yǎng)基，其中附加了2 mg/L 2，4-二苯氧基乙酸(2，4-D)、0.2 mg/L 6-芐氨基嘌呤(6-BA)、3%蔗糖和0.65%瓊脂，pH值為5.8～6.0，繼代培養(yǎng)基為MS固體培養(yǎng)基，其中附加了1.5 mg/L 2，4-D、0.5 mg/L 6-BA、500 mg/L水解酪蛋白(CH)、3%蔗糖和0.65%瓊脂，pH值為5.8～6.0。取疏松的黃色顆粒狀愈傷組織用于游離原生質(zhì)體。

1.2.2 原生質(zhì)體的游離與純化 將繼代6～16 d的約1 g松軟的淡黃色顆粒狀愈傷組織放于10 mL酶混合液中游離。酶混合液組成成分為2%纖維素酶(Cellulase Onozuka R10)、1%半纖維素酶和0.5%果膠酶、0.05 mol/L CaCl2、0.4 mol/L甘露醇和0.1% 2-嗎啉乙磺酸(MES)。原生質(zhì)體的游離和純化方法同文獻(xiàn)[13]。

1.2.3 原生質(zhì)體的培養(yǎng) 將純化的原生質(zhì)體置于6 cm大小的玻璃培養(yǎng)皿中，懸浮于含有不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物的DPD液體培養(yǎng)基中，依次調(diào)節(jié)其密度為2×105、3×105、4×105、4×105個(gè)/mL，采用配方為1.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mol/L甘露醇+2%蔗糖+500 mg/L 水解酪蛋白的DPD液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。定期觀察培養(yǎng)過程中原生質(zhì)體的生長(zhǎng)分裂狀況。相對(duì)分裂頻率以培養(yǎng)15 d時(shí)發(fā)生分裂的原生質(zhì)體數(shù)占植板上存活的原生質(zhì)體總數(shù)的比例(百分?jǐn)?shù))表示。每次隨機(jī)檢查20個(gè)視野，每個(gè)處理至少重復(fù)3次。原生質(zhì)體的活力用酚藏花紅染色法測(cè)定[14]。

1.2.4 再生愈傷組織的形成與分化 將獲得的肉眼可見的顆粒狀愈傷組織轉(zhuǎn)移至pH值為6.0、附加了2%蔗糖與 2 mg/L 2，4-D、0.2 mg/L 6-BA的DPD固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照度為40 μmol/(m2·s)，每天光照 10 h。然后放入含有不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合的MS分化培養(yǎng)基(表1)上進(jìn)行分化。培養(yǎng)條件為溫度(25±2) ℃、光照度400 μmol/(m2·s)。

表1 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合

2 結(jié)果與分析

2.1 不同繼代培養(yǎng)時(shí)間的愈傷組織對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

將由秦艽嫩葉誘導(dǎo)獲得的愈傷組織在MS固體繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中觀察到愈傷組織逐漸呈淡黃色疏松顆粒狀，可以認(rèn)為是進(jìn)行原生質(zhì)體游離的適宜材料。將愈傷組織轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)取材時(shí)間不同時(shí)，游離原生質(zhì)體的產(chǎn)量表現(xiàn)出一定的差異。由圖1可以看出，無論是剛轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基的愈傷組織，還是生長(zhǎng)16 d后的愈傷組織，分離原生質(zhì)體的產(chǎn)量都較低。而繼代后生長(zhǎng)10～12 d的愈傷組織處于旺盛增殖狀態(tài)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力均較高，1 g愈傷組織最多可分離出4.5×106個(gè)原生質(zhì)體，原生質(zhì)體活力在80%以上。由此可見，大葉秦艽繼代12 d時(shí)比較適合用于分離原生質(zhì)體。

2.2 培養(yǎng)密度對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響

不同原生質(zhì)體培養(yǎng)密度對(duì)秦艽原生質(zhì)體植板率的影響不同，過低或過高的原生質(zhì)體培養(yǎng)密度都會(huì)導(dǎo)致秦艽原生質(zhì)體植板率下降。由圖2可以看出，在秦艽原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中，低密度(2×105個(gè)/mL)條件下的植板率在37%左右；而原生質(zhì)體密度達(dá)到4×105個(gè)/mL時(shí)，秦艽的植板率明顯提高，接近80%；當(dāng)培養(yǎng)密度繼續(xù)升高時(shí)，植板率開始有所下降。

2.3 原生質(zhì)體來源的愈傷組織形成和試管苗的分化

本研究結(jié)果顯示，原生質(zhì)體在附加了1.5 mg/L 2，4-D、

0.5 mg/L 6-BA、0.3 mol/L甘露醇、2%蔗糖和500 mg/L水解酪蛋白的DPD液體培養(yǎng)基中的持續(xù)分裂效果最好。圖3-b、圖3-c為秦艽原生質(zhì)體細(xì)胞第1次分裂顯微觀察結(jié)果；圖3-d為原生質(zhì)體細(xì)胞第2次分裂的顯微觀察結(jié)果；圖3-e、圖3-f、圖3-g為原生質(zhì)體多次分裂形成的細(xì)胞團(tuán)。待原生質(zhì)體形成的小細(xì)胞團(tuán)生長(zhǎng)至2 mm大小的愈傷組織(圖3-h)時(shí)，轉(zhuǎn)至“1.2.4”節(jié)中提到的DPD固體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增。

將擴(kuò)增后的愈傷組織放入表1的6種培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明，2，4-D對(duì)大葉秦艽的分化影響差異不大，而當(dāng)6-BA濃度等于1.2 mg/L時(shí)，再生幼苗出現(xiàn)玻璃化(表2)。其中5號(hào)培養(yǎng)基是大葉秦艽由胚狀體分化的最佳培養(yǎng)基，將擴(kuò)增后的愈傷組織繼代轉(zhuǎn)入該培養(yǎng)基25 d，即可看到大量的胚狀體產(chǎn)生(圖4-a)，分化率可達(dá)96.55%。

表2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)愈傷組織分化的影響

將形成含2張子葉的幼苗(圖4-b)放入含有0.1 mol/L 6-BA、0.1 mol/L NAA，pH值為5.8的MS固體培養(yǎng)基上，可以同時(shí)促進(jìn)苗和根的生長(zhǎng)(圖4-c)，至苗高為5 cm左右時(shí)，可進(jìn)行煉苗，將其移入土壤中(圖4-d)。

3 討論與結(jié)論

在原生質(zhì)體游離和純化過程中，酶的種類、濃度、酶解時(shí)間及酶液的滲透壓對(duì)于原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力都有很大影響[8，15]，但是進(jìn)行原生質(zhì)體游離的供體材料——愈傷組織的狀態(tài)對(duì)于原生質(zhì)體的游離也是至關(guān)重要的，適合原生質(zhì)體游離的愈傷組織培養(yǎng)時(shí)間與植物材料有關(guān)，大多數(shù)植物材料愈傷組織以在旺盛分裂期的游離原生質(zhì)體最佳[16]。本試驗(yàn)采用含2%纖維素酶、1%半纖維素酶和0.5%果膠酶及 0.05 mol/L CaCl2、0.4 mol/L甘露醇和0.1% 2-嗎啉乙磺酸的混合酶液進(jìn)行秦艽原生質(zhì)體游離，在供體愈傷組織接種 10～12 d時(shí)，獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力較高，產(chǎn)量(鮮質(zhì)量)為4.5×106個(gè)/g，活力達(dá)80%以上。

合適的原生質(zhì)體培養(yǎng)密度和液體培養(yǎng)條件，是原生質(zhì)體游離純化后能夠保持較高分裂頻率的保證[17-18]。本試驗(yàn)采用DPD液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中除了含有合適的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(1.5 mg/L 2，4-D和0.5 mg/L 6-BA)外，還增加了 0.3 mol/L 甘露醇和2%蔗糖作為滲透調(diào)節(jié)劑和碳源，另加入了500 mg/L水解酪蛋白用于促進(jìn)原生質(zhì)體的生長(zhǎng)和分裂。隨著原生質(zhì)體細(xì)胞生成細(xì)胞壁、分裂成為細(xì)胞團(tuán)，所需的滲透壓降低，因此在轉(zhuǎn)入固體DPD培養(yǎng)基時(shí)，將甘露醇去除。

原生質(zhì)體來源的愈傷組織的再分化，也遵循組織培養(yǎng)中的激素模式，在生長(zhǎng)素和分裂素比例恰當(dāng)時(shí)，分裂頻率較高。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，過高的6-BA濃度(≥1.2 mg/L)會(huì)引起再生苗的玻璃化，而在過低的6-BA濃度(≤0.8 mg/L)下，分化率較低。當(dāng)生長(zhǎng)素2，4-D濃度為0.2 mg/L、細(xì)胞分裂素 6-BA濃度為1.0 mg/L時(shí)，分裂率達(dá)到了最高值，為96.55%。