賴(lài)宏剛， 蔣云升， 張?jiān)裕?曹 宏， 肖 歡

(1.揚(yáng)州大學(xué)旅游烹飪學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225127； 2.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇揚(yáng)州 225007

冷鮮雞是指經(jīng)檢疫檢驗(yàn)后屠宰得到的雞胴體，經(jīng)迅速冷卻使其溫度在1 h內(nèi)降到0～4 ℃，并保持在0～4 ℃下加工、流通和零售的鮮雞肉[1]。冷鮮雞在生產(chǎn)、加工和儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中，不可避免地會(huì)被空氣、容器、包裝材料、原料本身等所攜帶的細(xì)菌污染，又因?yàn)槠錉I(yíng)養(yǎng)成分豐富和含水量高[2]，一旦條件適宜，其攜帶的微生物就會(huì)迅速生長(zhǎng)繁殖，出現(xiàn)變色、變味以及表面發(fā)黏、產(chǎn)生臭味等不良變化[3]，從而使其貨架期縮短，這也成為限制冷鮮雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。因此，建立系列的綜合保鮮技術(shù)研究就成為解決冷鮮雞及醬雞制品發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題，而腐敗菌的分離鑒定是這個(gè)問(wèn)題得以解決的基礎(chǔ)。

本研究采用平板劃線(xiàn)分離方法分離純化冷鮮雞中的優(yōu)勢(shì)微生物菌群，再通過(guò)傳統(tǒng)的生理生化試驗(yàn)及16S rDNA測(cè)序的方法，對(duì)冷鮮雞中的主要腐敗菌進(jìn)行菌種鑒定，從而為靶向控制冷鮮雞加工過(guò)程中的微生物生長(zhǎng)提供依據(jù)，達(dá)到延長(zhǎng)貨架期的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

活雞，購(gòu)于當(dāng)?shù)亟瘀位▓@菜市場(chǎng)，經(jīng)獸醫(yī)檢驗(yàn)檢疫合格[4]。聚乙烯(polyethylene，簡(jiǎn)稱(chēng)PE)食品包裝袋，購(gòu)自江陰市永達(dá)復(fù)合包裝有限公司。

1.2 試劑

蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、瓊脂、無(wú)水氯化鈉、無(wú)水硫酸鉀、甘油、磷酸鹽緩沖液、二苯胺、醋酸、檸檬酸銨、乙酸鈉、吐溫-80、硫酸鎂、硫酸錳、CaCO3、膽鹽、H2SO4、H2O2、石蠟、中性紅、結(jié)晶紫、MgSO4、KHPO4、D-甘露醇、檸檬酸及其他化學(xué)試劑均為分析純級(jí)別；1%酚紅溶液、無(wú)菌生理鹽水、革蘭氏染色液、奈氏試劑、格里斯氏試劑、吲哚試劑，為筆者自行配制；微量生化反應(yīng)管，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.3.1 培養(yǎng)基的配制 (1)平板計(jì)數(shù)瓊脂(plate count agar，簡(jiǎn)稱(chēng)PCA)培養(yǎng)基，用于細(xì)菌的培養(yǎng)。主要配方如下：5.0 g胰蛋白胨，2.5 g酵母浸膏，1.0 g葡萄糖，15 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水，將pH值調(diào)至7.2±0.02，于121 ℃滅菌15 min。(2)假單胞菌計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(Pseudomonades培養(yǎng)基)，用于假單胞菌的分離培養(yǎng)。主要配方如下：20 g蛋白胨，5 g無(wú)水氯化鈉，1 g無(wú)水硫酸鉀，13.6 g瓊脂，10 mL甘油，1 000 mL蒸餾水，將pH值調(diào)至7.2，于 121 ℃ 滅菌15 min。(3)乳酸菌計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(MRS)，用于乳酸桿菌的分離培養(yǎng)。主要配方如下：2 g檸檬酸銨，5 g乙酸鈉，20 g葡萄糖，1 mL吐溫-80，0.58 g硫酸鎂，0.25 g硫酸錳，15 g瓊脂，20 g CaCO3，1 000 mL 蒸餾水，將pH值調(diào)至6.2～6.4，于121 ℃滅菌 15 min。(4)結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂(VRBGA)培養(yǎng)基，用于腸桿菌的分離培養(yǎng)。主要配方如下：3 g酵母浸膏，7 g 蛋白胨，1.5 g膽鹽，5 g氯化鈉，10 g乳糖，0.03 g中性紅，0.002 g結(jié)晶紫，15 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水，將pH值調(diào)至 7.3～7.5，于121 ℃滅菌15 min。(5)熱殺索絲菌計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(STAA)，用于熱殺索絲菌的分離培養(yǎng)。主要配方如下：20 g 蛋白胨，15 g甘油，1 g MgSO4，2 g酵母提取物，1 g KHPO4，13 g瓊脂，溶于 1 000 mL 蒸餾水。滅菌后，加入下列滅菌的水溶液：50 μg/mL 鏈霉素硫酸鹽，50 μg/mL環(huán)己六亞胺，50 μg/mL乙酸鹽。

1.3.2 培養(yǎng)條件 本研究中腐敗菌微生物的培養(yǎng)條件見(jiàn)表1。

1.3.3 主要儀器與設(shè)備 3730XL型測(cè)序儀，Applied Biosystem；FR980型凝膠成像儀，上海復(fù)日科技儀器有限公司；DYCP-31DN型DNA電泳槽，北京六一儀器廠(chǎng)；DYY-5型穩(wěn)壓電泳儀，北京六一儀器廠(chǎng)；2720thermal cycler型PCR儀，Applied Biosystems；HC-2518R冷凍高速離心機(jī)，上海伊沐醫(yī)療器械有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BCD-203型冰箱，海信(北京)電器有限公司；BL3-120型超聲波清洗機(jī)，上海比朗儀器有限公司；DT-200 型電子天平，常熟雙杰測(cè)試儀器廠(chǎng)；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋，臨安同華電器有限公司；HSX-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；pHS-3C型精度pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；QYC-200型全溫培養(yǎng)搖床，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；XSP-13A型生物顯微鏡，江南光學(xué)儀器廠(chǎng)；YX280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHG-9148A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海三申醫(yī)療器械有限公司。

表1 本研究中腐敗菌分離、計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

1.4 方法

1.4.1 樣品的制備 冷鮮雞制備步驟如下：活雞宰殺→剃毛凈膛→修整清洗→采用濃度為50 mg/L的次氯酸鈉溶液[5]浸泡、淋洗→用冷卻水沖洗、瀝干→真空包裝→4 ℃保藏。

1.4.2 微生物菌相構(gòu)成分析 冷鮮雞樣品于4 ℃儲(chǔ)存至第10天，樣品腐敗變質(zhì)。于無(wú)菌條件下稱(chēng)取25 g樣品，剪碎后置于裝有225 mL無(wú)菌生理鹽水的錐形瓶中，均質(zhì)30 min，取上清，依次作1 ∶10遞增稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度作3個(gè)平行，倒入冷至45 ℃的選擇性培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)[6]。

1.4.3 腐敗菌菌種的分離純化 從選擇性培養(yǎng)基上挑取典型菌落，在其相應(yīng)平板上作劃線(xiàn)分離，分離純化2～3次，將代表性菌株移殖至斜面，保藏備檢[7]。

1.4.4 菌落形態(tài)的觀(guān)察 在顯微鏡下觀(guān)察已分離純化的單個(gè)菌落的大小、顏色、形狀、隆起度、邊緣結(jié)構(gòu)、表面光滑或粗糙度、光澤度、透明度和質(zhì)地等[8]。通過(guò)革蘭氏染色、鞭毛染色及芽孢染色，對(duì)重新培養(yǎng) 18～24 h且長(zhǎng)勢(shì)好的單菌落進(jìn)行顯微鏡觀(guān)察。菌體形態(tài)包括細(xì)胞形態(tài)(短桿、長(zhǎng)桿及球狀等)；革蘭氏染色分陰性和陽(yáng)性[9]。

1.4.5 生理生化試驗(yàn) 根據(jù)《食品微生物鑒定圖譜》及《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]，進(jìn)行氧化酶、接觸酶、葡萄糖氧化發(fā)酵、精氨酸雙水解酶活性以及V-P(Voges-Proskauer)試驗(yàn)，根據(jù)菌落形態(tài)、菌體形態(tài)和生理生化試驗(yàn)結(jié)果，最終將細(xì)菌初步鑒定到科和屬。

1.4.6 腐敗菌的PCR檢測(cè)

1.4.6.1 基因組DNA的提取 采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA。

1.4.6.2 菌種鑒定基因序列擴(kuò)增 以基因組DNA為模板，進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增，采用通用引物擴(kuò)增16S rDNA，其中7F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，1540R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。

PCR反應(yīng)體系(25 μL)：0.5 μL模板(20～50 ng/μL基因組DNA)，2.5 μL 10×PCR buffer，1 μL dNTP(2.5 mmol/L)，0.2 μL酶，0.5 μL引物F(10 μmol/L)，0.5 μL引物R(10 μmol/L)，加雙蒸水至25 μL。

PCR循環(huán)條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.4.6.3 序列片段分析及發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 將序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，在GenBank中使用BLAST程序進(jìn)行同源性比較，獲得最相似典型菌株的DNA序列。運(yùn)用MEGA 6軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷鮮雞中微生物菌相的構(gòu)成

將冷鮮雞樣品于4 ℃保藏培養(yǎng)第10天，檢測(cè)其菌落總數(shù)達(dá)到1.2×105CFU/g，其腐敗菌相構(gòu)成如圖1所示，可見(jiàn)冷鮮雞的腐敗菌相以假單胞菌(占比51.0%)和乳酸菌(占比31.5%)為主，其次是熱殺索絲菌(占比13.3%)、腸桿菌(占比4.3%)。

2.2 菌落形態(tài)特征

將純化得到的菌種分別命名為J1、C1、R1、S1，鑒定得到的菌落特征及菌體形態(tài)見(jiàn)表2。

表2 菌落特征及菌體形態(tài)

注：“+”表示陽(yáng)性，“-”表示陰性。表3同。

2.3 腐敗菌顯微鏡圖

通過(guò)革蘭氏染色試驗(yàn)初步分析這4種分離得到的細(xì)菌。根據(jù)菌體的形態(tài)大小、染色結(jié)果初步確定J1、S1為革蘭氏陰性細(xì)菌，C1、R1為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。此外可以看出，這4株菌并無(wú)芽孢(圖2)。

2.4 生理生化鑒定

根據(jù)《食品微生物鑒定圖譜》及《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]，通過(guò)鏡檢各種菌在顯微鏡下的菌體形態(tài)、革蘭氏染色情況等，結(jié)合表3的生理生化試驗(yàn)結(jié)果，初步判定J1為假單胞菌屬，C1為腸桿菌科，R1為乳酸菌屬，S1為環(huán)絲菌屬。

表3 生理生化指標(biāo)測(cè)試結(jié)果

注：“NT”表示未檢測(cè)。

2.5 16S rDNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

將分離出的腐敗菌典型菌株的單菌落培養(yǎng)后提取DNA，進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增。由圖3可以看出，4株菌得出的條帶大小不同，J1、R1、C1、S1條帶大小分別為1 482、1 351、1 528、1 365 bp。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

將測(cè)序所得16S rDNA序列與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行比對(duì)，選取相似性高的菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖4和表3所示。通過(guò)同源性比較可得：J1與假單胞菌屬的熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)同源性最高；C1與腸桿菌屬的陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)同源性最高；R1與乳桿菌屬的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)同源性最高；S1與環(huán)絲菌屬的熱殺索絲菌(Brochothrixthermosphacta)同源性最高。

表3 各菌株測(cè)序的種屬關(guān)系

熒光假單胞菌隸屬于假單胞菌屬。假單胞菌是導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的主要微生物，也是冷鮮雞中存在的優(yōu)勢(shì)菌[11]。這是因?yàn)榧賳伟诘蜏貤l件下也能利用葡萄糖迅速生長(zhǎng)繁殖，使肉制品腐敗變質(zhì)，從而影響其貨架期。冷鮮雞生產(chǎn)加工和保藏期間的溫度為4 ℃，有利于假單胞菌的生長(zhǎng)繁殖。

植物乳桿菌隸屬于乳桿菌屬，在有氧時(shí)生長(zhǎng)差，通常是無(wú)氧包裝肉類(lèi)食品的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，廣泛存在于動(dòng)物、蔬菜和食品中[12]。

陰溝腸桿菌隸屬于腸桿菌屬。腸桿菌屬普遍源于人和動(dòng)物的腸道排泄物，這可能與冷鮮雞在生產(chǎn)、加工和儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中遭到活雞腸道內(nèi)容物的污染有關(guān)[13]。

熱殺索絲菌隸屬于環(huán)絲菌屬，在0～30 ℃下均能生長(zhǎng)，主要存在于肉制品中。它也是肉類(lèi)食品中重要的腐敗菌，因此是引起真空包裝冷鮮雞腐敗的主要微生物[14]。

3 討論

趙文紅等從腐敗冰鮮鴨中鑒定出假單胞菌屬、氣單胞菌屬、乳酸菌屬、腸桿菌屬、節(jié)桿菌屬、紫色桿菌屬等[8]。周濤等對(duì)鹽水鵝的主要腐敗菌進(jìn)行測(cè)序和序列比對(duì)，得到最終的鑒定結(jié)果為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)[15]。梁慧等通過(guò)傳統(tǒng)生理生化試驗(yàn)鑒定冷鮮雞中腐敗微生物的結(jié)果表明，冷鮮雞中腐敗微生物有腸桿菌、葡萄球菌、乳酸菌及假單胞菌，16S rDNA檢測(cè)結(jié)果表明，冷鮮雞中腐敗微生物含有腸桿菌、葡萄球菌、乳酸菌、節(jié)桿菌、克氏庫(kù)克菌及假單胞菌等，兩者相對(duì)比有較多相同的微生物[16]。高磊等從變質(zhì)冷鮮雞的腿肉中分離并通過(guò)感官評(píng)價(jià)篩得到5株優(yōu)勢(shì)腐敗菌，經(jīng)菌落特征、菌體形態(tài)、生理生化試驗(yàn)以及16S rDNA序列分析，結(jié)果顯示為類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌、熱殺索絲菌、腐生葡萄球菌、無(wú)色桿菌、液化沙雷氏菌[9]。本研究對(duì)貯藏在4 ℃的冷鮮雞進(jìn)行菌相分析可知，冷鮮雞的腐敗菌相以假單胞菌(51.0%)和乳酸菌(31.5%)為主，其次是熱殺索絲菌(13.3%)、腸桿菌(4.3%)。本研究對(duì)分離出的主要腐敗菌進(jìn)行分離、純化，然后進(jìn)行菌落特征、菌體形態(tài)觀(guān)察及生理生化鑒定，初步確定J1為假單胞菌屬，C1為腸桿菌屬，R1為乳酸菌屬，S1為索絲菌屬。然后提取細(xì)菌的16S rDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，經(jīng)測(cè)序和序列比對(duì)，得到最終的鑒定結(jié)果：J1為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)，C1為陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)，R1為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，S1為熱殺索絲菌(Brochothrixthermosphacta)。