吳海波, 薛興亞, 李奎永, 周永正*

(1. 浙江華譜新創(chuàng)科技有限公司, 浙江 溫嶺 317503; 2. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點實驗室, 遼寧 大連 116023)

近年來,隨著高效液相色譜技術(shù)的發(fā)展,特別是工業(yè)制備色譜的推廣與應(yīng)用,硅膠基質(zhì)填料的液相制備技術(shù)越來越成熟[1-3]?？讖?～10 nm的硅膠基質(zhì)在色譜上應(yīng)用最為普遍,制備工藝也相對簡單、穩(wěn)定。但在分離蛋白質(zhì)、多肽、聚合物等大分子物質(zhì)時,為了讓樣品可以進(jìn)入孔內(nèi)與鍵合相接觸,往往需要采用由更大孔徑的硅球制備的固定相[4,5]。另外,一些由聚合物涂覆或鍵合制備的固定相也需要使用大孔徑的硅膠做基質(zhì)[6,7]。

在手性分離領(lǐng)域,多糖衍生物型固定相是應(yīng)用最廣的一類手性固定相,可解決90%以上的手性分離問題。此類固定相由直鏈淀粉或纖維素的衍生物涂覆或鍵合到硅膠表面制得。多糖衍生物的聚合度大約200～300,所用的基質(zhì)通常為孔徑100 nm的大孔硅膠[7]。目前,手性制備分離成本較高,主要因為填料較為昂貴。在填料成本中,大孔硅膠基質(zhì)也占據(jù)相當(dāng)部分的比例。

大孔硅膠可由小膠粒直接燒結(jié)制得,但機械穩(wěn)定性一般較差或孔徑單一,不易控制。目前,大孔硅膠多以廉價的小孔徑硅膠作為原料,采用一定的擴孔方法進(jìn)行制備。擴孔方法一般有兩種:熱液法和焙燒法[8]。熱液法是將硅膠分散于水或氨水溶液中,于高壓釜內(nèi)進(jìn)行高溫擴孔處理;焙燒法是先將硅膠浸漬在NaCl、LiCl或KNO3等無機鹽配制的復(fù)鹽溶液中,取出烘干后,混合物經(jīng)高溫焙燒進(jìn)行擴孔[9-11]。

本研究考察并對比了兩種擴孔方式的擴孔效果,將所制得的100 nm大孔硅膠分別涂覆纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)制成手性固定相,并評價了手性分離能力。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

實驗所用球形硅膠,平均粒徑5 μm,孔徑10 nm,由浙江華譜新創(chuàng)科技有限公司提供。

微晶纖維素為化學(xué)純,購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。3,5-二甲基苯基異氰酸酯、3-氨丙基三甲氧基硅烷、NaCl、LiCl·H2O、四氫呋喃、吡啶、無水乙醇等試劑為分析純,購自阿拉丁試劑(上海)有限公司。

分析用高效液相色譜為Waters 515泵系統(tǒng),配7725i手動進(jìn)樣器、2489檢測器(美國Waters公司)。JXR1200-30a馬弗爐(上海均珂儀器公司)。Tristar Ⅱ 3020比表面分析儀(美國Micromeritics Instrument公司)。Elementar Vario EL Ⅲ元素分析儀(德國Elementar Analysensysteme公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1熱液擴孔

將160 g硅膠分散于300 mL 22 g/L 氟化鈉水溶液中,攪拌均勻,倒入500 mL高壓釜中,密封后置于烘箱內(nèi),加熱至設(shè)定溫度保持一段時間。自然冷卻,過濾,純水洗滌至中性,50 ℃真空干燥。

1.2.2焙燒擴孔

將11.25 g LiCl·H2O和7.5 g NaCl溶于200 mL水中,超聲溶解后加入100 g硅膠,超聲10 min,置于150 ℃烘箱中烘干。之后,置于馬弗爐中焙燒5 h,取出。冷卻至室溫,加水分散,過濾,水洗,50 ℃真空干燥。

1.2.3硅膠氨基化

將50 g擴孔后的硅膠分散于250 mL 2.5 mol/L HCl溶液中于100 ℃回流6 h,過濾,水洗至中性,干燥。硅膠分散于200 mL甲苯中,加入10 mL 3-氨丙基三甲氧基硅烷,于110 ℃回流反應(yīng)16 h,過濾,用甲醇洗滌,于50 ℃真空干燥。元素分析結(jié)果:熱液擴孔,N 0.20% , C 0.87% , H 0.36% ;焙燒擴孔,N 0.18% , C 0.81% , H 0.33% 。

1.2.4纖維素衍生物的合成與涂覆

將5.0 g微晶纖維素分散于100 mL無水吡啶中,加入18.1 g(4倍于纖維素中羥基的物質(zhì)的量)3,5-二甲基苯基異氰酸酯,于100 ℃下反應(yīng)24 h,向反應(yīng)體系中加入甲醇,析出沉淀,過濾,于50 ℃真空干燥得15.0 g固體。元素分析結(jié)果:N 6.94% , C 65.36% , H 5.88% 。凝膠滲透色譜(GPC)測得重均相對分子質(zhì)量Mw=152 123,聚合度約250。

取4.0 g纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)溶解于100 mL四氫呋喃中,加入16.0 g氨基化的大孔硅膠,拌勻,于旋蒸儀上50 ℃緩慢旋干(約3 h)。在旋干后的固定相中加入120 mL乙醇,超聲分散,80 ℃攪拌回流3 h,過濾,乙醇洗滌,于50 ℃真空干燥。元素分析:熱液擴孔,N 1.25% , C 11.18% , H 1.43%(實際涂覆量18.0% ,涂覆率90% );焙燒擴孔,N 1.34% , C 12.43% , H 1.66%(實際涂覆量19.2% ,涂覆率96% )。

1.2.5色譜柱的裝填與評價

固定相加甲醇勻漿,于50 MPa壓力下進(jìn)行裝柱(250 mm×4.6 mm),甲醇頂替15 min。

系統(tǒng)死時間t0由1,3,5-三叔丁基苯進(jìn)行測定。保留因子k=(t-t0)/t0;分離因子α=k2/k1;分離度Rs=1.18×[(t2-t1)/(W1+W2)],其中W1與W2表示兩峰的半峰寬。

手性分離條件:流速,1.0 mL/min;溫度,25 ℃;檢測波長,220 nm或254 nm。流動相:分析物1～6,正己烷-異丙醇(90∶10, v/v);分析物7～9,正己烷-異丙醇(80∶20, v/v);分析物10,正己烷-異丙醇-三氟乙酸-二乙胺(90∶10∶0.2∶0.1, v/v/v/v);分析物11,正己烷-異丙醇-三氟乙酸-二乙胺(80∶20∶0.2∶0.1, v/v/v/v)。

穩(wěn)定性試驗考察:樣品,分析物1;流動相,100%甲醇;溫度,30 ℃;流速,0.8 mL/min;檢測波長220 nm;進(jìn)樣次數(shù),100針。

2 結(jié)果與討論

2.1 熱液法擴孔

熱液法擴孔是基于硅膠骨架的Si-O-Si鍵在高溫、高壓的水蒸氣中不斷水解和再縮聚，從而達(dá)到擴孔效果[8]。通常,擴孔時會在水中加入少量氨水提供堿性條件,以促進(jìn)細(xì)小基本粒子的溶解和在大基本粒子上的縮聚。由于氨水易揮發(fā),添加量不易控制。本實驗中,在水中加入了少量氟化鈉來提供弱堿性環(huán)境,另外水解生成的少量氫氟酸也可以增強對細(xì)小基本粒子的溶解性。

表1列舉了3個條件下水熱擴孔的結(jié)果,圖1給出了其中2號條件下擴孔后的硅膠與Fuji-1000硅膠的掃描電鏡圖?？梢钥闯?純水條件下擴孔較慢。160 ℃加熱48 h后,比表面與孔徑變化均很小。相同條件下,22 g/L 氟化鈉中硅膠擴孔則接近100 nm。擴孔40 h后,比表面與孔徑變化已相對緩慢。由圖1可看出,熱液擴孔的硅膠孔道不均勻,孔徑跨度較大。

表 1 熱液法擴孔條件與結(jié)果

*Fuji-1000 is commercial 100-nm silica from Fuji Silysia Chemical Ltd.

圖 1 22 g/L NaF中160 ℃擴孔48 h的硅膠以及Fuji-1000硅膠的掃描電鏡(SEM)圖Fig. 1 Scanning electron microscopy (SEM) images of silica treated in 22 g/L NaF at 160 ℃ for 48 h and Fuji-1000 silica gel

此外,實驗發(fā)現(xiàn)熱液擴孔后的硅膠夾雜大量硅膠細(xì)屑,篩除后硅膠有約10%損失?？赡苁菙U孔過程中一些基質(zhì)粒子溶解后在溶液中發(fā)生了再縮聚。

2.2 焙燒法擴孔

焙燒擴孔是基于高溫條件下對原有孔結(jié)構(gòu)的破壞,細(xì)小的SiO2質(zhì)點在復(fù)鹽的助熔作用下進(jìn)一步“熔結(jié)”長大,從而獲得大孔結(jié)構(gòu)[12]。常用的復(fù)鹽為NaCl、LiCl和KNO3組成的三元復(fù)鹽體系。通常在10～200 nm范圍內(nèi),NaCl+LiCl是比較好的復(fù)鹽體系。本實驗選擇該體系對焙燒溫度、時間和鹽量進(jìn)行了考察。具體焙燒條件和結(jié)果見表2。

表 2 焙燒法擴孔條件與結(jié)果

*The masses of LiCl·H2O and NaCl indicate amounts added in per 10 g silica.

圖 2 焙燒擴孔后的硅膠掃描電鏡圖Fig. 2 SEM images of silica treated by baking No. 6 in Table 2.

在表2 No. 1和No. 2條件中,每10 g硅膠加入2.25 g LiCl·H2O和1.5 g NaCl,在520 ℃下焙燒。結(jié)果表明,擴孔速度較快,1 h便達(dá)到了110 nm; 3 h后,平均孔徑已至210 nm。由于擴孔較快不易控制,No. 3條件將加入的鹽量減半。3 h后,平均孔徑達(dá)到120 nm,擴孔速度明顯降低。之后降低了擴孔溫度,No. 4、5、6條件中,將焙燒溫度降為500 ℃,可以看出焙燒2、3、5 h的結(jié)果比較接近,比表面變化較小,平均孔徑為90～100 nm。因此,最佳擴孔條件確定為:每10 g硅膠加入1.125 g LiCl·H2O和0.75 g NaCl, 500 ℃焙燒3～5 h。該條件擴孔結(jié)果穩(wěn)定,便于實際操作控制。

圖2為表2中No. 6條件擴孔后硅膠的掃描電鏡圖。從形態(tài)上看,該大孔硅膠與商品化的Fuji-1000硅膠非常相似?？椎垒^熱液法擴孔的硅膠更均勻。

此外,實驗發(fā)現(xiàn)焙燒法擴孔后的硅膠基本無質(zhì)量損失,也無硅膠細(xì)屑產(chǎn)生。因而,后處理也較熱液擴孔法簡單。這表明,焙燒擴孔時SiO2質(zhì)點的“熔結(jié)”均在硅膠表面進(jìn)行,未導(dǎo)致硅膠粒子脫落。

2.3 手性固定相的制備與評價

基于大孔硅膠涂覆纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的手性固定相是目前選擇性最廣的手性固定相之一,由于合成、制備簡單,是許多實驗研究的對象[13]。本實驗分別選取熱液法和焙燒法擴孔得到的100 nm硅膠進(jìn)行氨基化修飾,之后涂覆纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯),制備了相應(yīng)的手性固定相CSP 1與CSP 2。

熱液法擴孔的硅膠涂覆后有明顯的顆粒團(tuán)聚現(xiàn)象,應(yīng)該是由于硅膠表面小孔較多,一些纖維素衍生物未能進(jìn)入孔道,在溶液中發(fā)生了析出,導(dǎo)致一些填料顆粒相互粘連。乙醇回流處理后,一些仍不分散的小顆粒被棄除。焙燒法擴孔的硅膠涂覆后分散性良好,幾乎無團(tuán)聚顆粒。從元素分析結(jié)果中也可以看出,焙燒法擴孔的硅膠涂覆量稍微高一些。由掃描電鏡圖(圖3)可以看出, CSP 2明顯具有較好的涂覆均勻性。

CSP 1與CSP 2裝柱(250 mm×4.6 mm)后,經(jīng)檢測前者死時間為2.6 min,后者死時間為2.9 min。前者的死體積更小,表明熱液法擴孔硅膠的孔隙率偏低。

圖4是11種手性化合物的結(jié)構(gòu),表3是固定相CSP 1與CSP 2對這些對映體的分離結(jié)果。

從表3中的結(jié)果可以看出,CSP 1與CSP 2對于樣品的保留均非常接近,但對于大部分分析物,CSP 2的選擇性明顯較CSP 1高。例如,化合物7和9在CSP 1上的分離微弱,但在CSP 2上可以得到基線分離;化合物6、10在CSP 2上的分離因子比CSP 1明顯大(差值>0.5)。而一些分析物即使在CSP 1與CSP 2上的分離因子相近,后者的分離度也明顯高于前者,如化合物2、4的手性分離。化合物7、10、4的分離色譜圖見圖5。

*CSP 1 based on hydrothermally treated silica; CSP 2 based on baking-treated silica.

CSP 2由于涂覆更均勻,裝柱柱效較高,因而對許多對映體的選擇性更好,分離度更高。而CSP 1由于固定相涂層不均勻,柱效偏低,分離效果往往較差。另外,CSP 1中由于大分子涂層無法進(jìn)入小孔,導(dǎo)致其內(nèi)部裸露的氨基會對樣品產(chǎn)生一些非對映選擇性的作用[11],從而削弱了固定相對一些對映體的選擇性。

為了考察CSP 2的分離穩(wěn)定性,以化合物1為例,100%甲醇做流動相,連續(xù)進(jìn)樣了100針。分離具有很好的重復(fù)性(見圖6),表明固定相穩(wěn)定性較好。

圖 5 化合物7、10、4在CSP 1與CSP 2上的分離譜圖Fig. 5 Chromatograms of compounds 7, 10 and 4 separated on CSP 1 and CSP 2

總的來看,焙燒擴孔法更為簡單、高效。擴孔后的硅膠孔徑分布較均勻,比較適合多糖衍生物涂覆。所制得的手性固定相選擇性好,裝柱柱效高,有利于手性樣品的分離與分析。

圖 6 化合物1在CSP 2上的重復(fù)進(jìn)樣譜圖Fig. 6 Chromatograms of repeated injections of compound 1 on CSP 2

3 結(jié)論

為制備100 nm大孔硅膠,本文考察了熱液法和焙燒法兩種擴孔方式。水熱法擴孔時,水溶液中加入氟化鈉可以增強擴孔效果,但所制得的大孔硅膠孔徑不均勻。焙燒法擴孔時,通過調(diào)節(jié)焙燒溫度、時間以及復(fù)鹽LiCl-NaCl的加入量可以有效控制擴孔效果。該方法簡單、高效,擴孔后的硅膠孔徑分布更加均勻。硅膠經(jīng)氨基修飾后涂覆纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)制得的手性固定相表現(xiàn)了較好的分離選擇性與較高的柱效,且穩(wěn)定性較好,有利于手性樣品的分離與分析。