徐婷婷，遲 波，毛 春，徐 虹

(1.南京工業(yè)大學食品與輕工學院材料化學工程國家重點實驗室，江蘇南京211800；2.南京師范大學化學與材料科學學院江蘇省生物功能材料重點實驗室，江蘇南京210023)

組織工程學是一門以材料科學和細胞生物學相結合、進行體外或體內構建組織或器官的新興學科。通常情況下，從病人的身上直接提取細胞，在支架上進行傳代和擴增。通過適當?shù)耐饨绱碳?，應用化學、生物、機械和電子等手段，在較短時間內形成新的組織。將這種新的組織重新植入病人體內，幫助其功能重建[1]。因此，應用于組織工程的支架必須滿足特定要求，包括：相互貫穿的高度多孔結構，以滿足細胞黏附和增殖的需求[2]；三維支架結構，最大化的模擬組織相關環(huán)境以便促進細胞的粘附遷移，快速形成新的細胞外基質，從而促進組織生長和營養(yǎng)及代謝產物的運輸[3]。

聚氨酯是一類在高分子結構主鏈上含有氨基甲酸酯基團(—NHCOO—)的聚合物[4]，因其具有良好的生物相容性、優(yōu)異的力學性能、耐磨損及易加工成型等優(yōu)點，因此被應用于人工心臟瓣膜、血管涂層和藥物控釋等眾多生物醫(yī)學領域?？紤]到聚氨酯滿足組織工程學材料的一般要求，將其加以修飾改性制備多孔結構聚氨酯，有望成為組織工程支架領域的熱門材料。目前，多孔結構聚氨酯的制備方法包括靜電紡絲法、冷凍干燥法和相分離法等[5]。

肝素作為一種重要的抗凝藥物，常在臨床上用于減少醫(yī)用材料表面的血栓形成[6]。它與抗凝血酶Ⅲ有很強的作用力，從而可以防止纖維蛋白凝塊的形成。通過將肝素共價接枝在聚合物的表面，可以發(fā)揮長效抗血栓功效[7]。與此同時，肝素可以與生長因子等多種具有肝素結合域的蛋白相互作用，從而使生長因子與受體結合，確保其功能完好，免受水解作用的破壞[8]。

血管內皮生長因子(VEGF)在內皮細胞的遷移、增殖、分化、小管形成和生存中發(fā)揮積極作用，是觸發(fā)和調節(jié)血管生成的主要因素之一[9]。在眾多肝素特異性結合生長因子中，VEGF可在體內誘導血管新生，得到組織工程領域研究者的廣泛關注。

本研究中，筆者采用肝素進行多孔聚氨酯薄膜的功能化改性，并且進一步采用VEGF對薄膜進行修飾，以制備生物活性涂層，同時對該涂層的血液相容性和細胞相容性進行分析評價，希望促進多孔聚氨酯組織工程材料在新生血管方向的應用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

聚氨酯R180A(PU,醫(yī)用級)，蘇州科頌聚合物有限公司；二甲亞砜(DMSO)、丙烯酸，國藥集團化學試劑有限公司；肝素(heparin)，Sigma中國有限公司；碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)，曲拉通(X-100)，上海阿拉丁試劑有限公司。

RT-2204C型半自動血凝儀，美國雷杜公司；BD FACSCalibur型流式細胞儀，美國BD公司；KH3200型超聲清洗儀，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；ESCALAB 250型X線光電子能譜(XPS)、Nicolet NEXUS670型紅外光譜儀,賽默飛世爾科技有限公司；SYNERGY2型酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱,上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；BX41型光學顯微鏡,日本奧林巴斯有限公司；SL200D型水接觸角儀，美國科諾工業(yè)有限公司； JMS-7600F型掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社。

1.2 聚氨酯多孔膜的制備

稱取PU溶解于DMSO中，90 ℃機械攪拌24 h，配制成終質量分數(shù)10%的均相溶液。將溶液轉移到直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，-20 ℃靜置24 h。將培養(yǎng)皿浸入冰水浴中，每3 h替換水溶液直到無肉眼可見溶劑浸出，用以除去有機溶劑DMSO。將制備好的多孔PU薄膜放入37 ℃烘箱干燥24 h，備用[10]。

1.3 肝素的固定

將制備好的多孔PU薄膜裁剪成2 cm×2 cm正方形，在異丙醇溶液中超聲洗滌10 min，放入37 ℃烘箱干燥24 h。取出多孔PU薄膜，采用低溫氧等離子體(120 W,10 s)處理。將處理后的多孔PU薄膜浸入丙烯酸溶液中浸泡12 h。然后將丙烯酸接枝的多孔PU薄膜浸入含有EDC(10 g/L)的檸檬酸鹽緩沖溶液 (pH 5,20 mL) 中于4 ℃下靜置2 h。最終將樣品浸入含肝素(1.25 g/L)的檸檬酸鹽緩沖溶液中4 ℃下反應24 h。取出PU薄膜，蒸餾水多次洗滌，室溫干燥[11]。

1.4 肝素修飾的多孔PU薄膜的形態(tài)與結構表征

1.4.1 表面結構表征

傅里葉變換衰減全反射紅外光譜可通過材料表面的反射信號獲取材料表層有機成分的結構信息。檢測樣品包括：多孔PU薄膜、肝素修飾的多孔PU薄膜。

采用電子光譜儀對薄膜的化學成分進行分析。

1.4.2 水接觸角測試

通過懸滴法測量薄膜的表面水接觸角，每個樣品所用水滴量為20 μL,平行實驗設置3組。

1.4.3 掃描電子顯微鏡(SEM)測試

將待測樣品表面噴金后，通過日本電子株式會社JMS-7600F型高分辨熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察樣品表面形貌。

1.4.4 力學性能測試

采用系列Ⅸ自動化材料測試系統(tǒng)測量薄膜的楊氏模量和斷裂應變，測試溫度22 ℃，濕度30%，速度50 mm/min。

1.5 肝素修飾的多孔PU薄膜的血液相容性表征

1.5.1 全血與血小板黏附測試

實驗用血為新鮮新西蘭白兔全血，采用真空采血管耳靜脈取血。為模擬體內環(huán)境，實驗前將多孔PU薄膜浸泡于磷酸鹽緩沖(PBS)溶液中(pH=7.4)平衡24 h。吸出PBS溶液，加入新鮮的全血(富血小板血漿)，37 ℃下孵化1 h。吸出溶液，采用PBS溶液多次洗滌，加入2.5%(質量分數(shù))的戊二醛固定液室溫固定30 min。再次采用PBS溶液洗滌，依次用不同體積分數(shù)乙醇-水溶液(50%、60%、70%、80%、90%、95%和100%)脫水處理，每次間隔30 min，室溫晾干。將樣品表面噴金，通過掃描電子顯微鏡觀察樣品表面血細胞和血小板黏附情況[12]。

1.5.2 體外凝血時間測試

體外凝血時間測定包括：活化部分凝血酶時間(APTT)和凝血酶原時間(PT)和凝血酶時間(TT)[13]。具體操作步驟如下。

1)制備貧血小板血漿：真空采血管耳靜脈抽取的新鮮兔全血以3 000 r/min轉速離心處理15 min，取上層血漿即為貧血小板血漿。

2)將裁剪好的薄膜樣品置于離心管中，加入1 mL貧血小板血漿。

3)37 ℃下孵育1 h，加入對應的APTT、PT和TT試劑。利用半自動血凝分析儀通過比濁法，根據(jù)待測樣品在凝血過程中的吸光度變化來確定凝血時間。每個樣品平行測試3次，同時以空白血漿作為空白對照[14]。

1.5.3 溶血率測試

將新鮮抽取的抗凝全血于1 500 r/min離心10 min除去上清液，再加入PBS后1 500 r/min 離心10 min， 重復洗滌2～3次，直至上清液澄清。用PBS溶液將所得紅細胞配制成2%的紅細胞懸浮液。將裁剪好的薄膜樣品置于離心管中，加入1 mL PBS溶液，同時加入1 mL 2%的紅細胞懸浮液。37 ℃靜置孵化1.5 h。取出薄膜，將混合溶液于1 500 r/min離心10 min，取200 μL上層液體轉移到96孔板中，在全自動酶標儀上讀取570 nm下的吸光值。每個樣品平行測試3次，同時設置PBS為陰性對照，蒸餾水為陽性對照，溶血率計算見式(1)。

溶血率=(ODt-ODnc)/(ODpc-ODnc)×100%

(1)

式中：ODt為樣品吸光度；ODnc為陰性對照吸光度； ODpc為陽性對照吸光度[15]。

1.5.4 紅細胞形態(tài)觀察

將1.5.3節(jié)中樣品孵化后離心得到的紅細胞滴在玻璃載玻片上，采用奧林巴斯光學顯微鏡觀察并記錄紅細胞形態(tài)[16]。

1.5.5 補體激活及血小板激活測試

將裁剪好的薄膜樣品與貧血小板血漿在37 ℃下孵育1 h。然后采用商用試劑盒C3a Elisa kit (BD OptEIATM)，通過測定活性片段C3a和C3a的脫-精氨酸的形成，來分析補體激活情況。

將裁剪好的薄膜樣品與貧血小板血漿在37 ℃下孵育1 h。使用流式細胞儀來評估血小板的活化狀態(tài)。通過測定熒光標記的血小板活化標記物——抗CD62P和血小板標記物——抗-CD42a的表達來衡量血小板激活的比例。

1.6 裝載VEGF并測試其細胞活力和增殖

將肝素修飾后的多孔PU薄膜浸泡于VEGF溶液中(50 ng/mL)，一定時間(2 h/24 h)后取出樣品，用PBS溶液洗滌后用于細胞培養(yǎng)。為了評估PU-heparin-VEGF對血管內皮細胞(HUVEC)細胞活力的影響，將樣品置于24孔板上，在每孔中加入5×105個細胞于完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)HUVEC。為了評估PU-heparin-VEGF對HUVEC細胞增殖的影響，預先對HUVEC進行饑餓處理(只添加20 g/L牛血清)12 h，然后將細胞接種于多孔PU薄膜上，接種密度為5×104個/孔，培養(yǎng)96 h。培養(yǎng)過后，通過測定酸性磷酸酶的活性來反映細胞活力和增殖情況。具體方法如下：細胞培養(yǎng)過后的樣品采用PBS溶液(1 mL)洗滌，之后置于培養(yǎng)箱中(37 ℃，5% CO2)，在緩沖溶液中(含0.1 mol/L，pH5.5乙酸鈉和0.1%曲拉通X-100)與對硝基苯磷酸(1 mg/mL)共孵化3 h。添加NaOH(1 mol/L)溶液終止反應，通過測量405 nm下的光密度(OD405)來計算活細胞的數(shù)量[17]。

圖2 多孔PU薄膜和多孔PU-肝素薄膜的光電子能譜圖 Fig.2 ESCA of porous PU and PU-heparin film

2 結果與討論

2.1 多孔PU薄膜的表面光譜分析

圖1 多孔PU薄膜的紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectrum of porous polyurethane film

圖2為多孔PU薄膜和多孔PU-肝素薄膜的光電子能譜圖。由圖2可知：多孔PU薄膜上主要的峰分別位于540～525 、408～396 、294～278 和174～162 eV，依次對應于O-1s、N-1s、C-1s和S-2p的峰。比較肝素修飾前后的多孔PU薄膜的峰值，O-1s、N-1s和C-1s的峰值沒有出現(xiàn)明顯變化，而修飾過后S-2p的峰值明顯增強，對應于肝素中磺酸根的峰(表1)。由此可以證明肝素修飾多孔PU薄膜成功。

表1 多孔PU薄膜和多孔PU-肝素薄膜的光電子能譜圖

2.2 多孔PU薄膜的水接觸角測試

通過水接觸角測試考察多孔PU薄膜的親水性，結果如圖3所示。由圖3可知：與未經修飾的多孔PU薄膜相比(142.82°)，修飾過后薄膜的水觸角明顯減小(38.72°)，這是由于肝素中含有大量的羧基、羥基以及醚鍵等親水性基團，使材料表面的親水性增強，以此可以說明肝素被成功修飾至PU薄膜上。

2.3 多孔PU薄膜的表面形貌表征

圖4為掃描電子顯微鏡觀察到的多孔PU薄膜的表面形貌。由圖4可知：由于在冷卻過程中聚合物溶液經歷了液相分離過程，因此，薄膜由許多大小不均一的致密孔結構組成，孔徑范圍為0.1～200 μm。此外，由于在接枝肝素的過程中使用了氧氣等離子處理，所以多孔PU-heparin膜樣品表面多孔結構受到一定程度的破壞，但貫通的孔結構依然存在，只是孔數(shù)量有一定減少，尤其是小孔的數(shù)量。多孔結構的保留為材料提供了較大的內表面積，為后期細胞的黏附和生長提供了保障。

圖3 多孔PU薄膜和多孔PU-肝素薄膜的水接觸角圖片F(xiàn)ig.3 Water contact angle pictures of porous PU and PU-heparin film

圖4 PU和PU-hep薄膜的掃描電子顯微鏡結果Fig.4 SEM images of porous PU and PU-heparin films

2.4 多孔PU薄膜的力學性能測試

表2顯示了多孔PU薄膜的力學性能測試結果。由表2可知：多孔PU薄膜的斷裂伸長率為446%，楊氏模量為1.295；多孔PU-heparin薄膜的斷裂伸長率為162%，楊氏模量為2.297。由于接枝肝素的過程中使用了等離子體處理，所以對膜的力學性能有一定損傷，多孔PU-heparin 薄膜的模量增大，斷裂伸長率明顯降低，多孔PU-heparin 薄膜的力學性能依然可以達到組織工程材料的要求[19]。

表2 多孔PU薄膜和多孔PU-肝素薄膜的斷裂伸長率和楊氏模量

2.5 多孔PU薄膜的血液相容性評價

2.5.1 全血與血小板黏附情況分析

圖5為多孔PU薄膜的血液相容性評價結果。由圖5可知：在多孔PU薄膜上可以看到明顯的紅細胞和血小板黏附情況，大部分的血小板形貌破壞出現(xiàn)偽足；而多孔PU-heparin 薄膜的表面幾乎未見黏附的紅細胞和血小板。這表明了修飾肝素可以賦予多孔PU-heparin 薄膜優(yōu)異的抗黏附特性。這是由于改性的肝素層中帶有一定的負電荷，而紅細胞膜本身也帶有負電荷，通過靜電排斥作用抑制了紅細胞的黏附。

圖5 血細胞黏附實驗結果Fig.5 Results of blood-cell adhesion

2.5.2 體外凝血時間分析

體外凝血時間APTT、PT和TT常在臨床上被用于判斷血漿的異常情況。同時，它也可以被用于判斷生物材料的體外抗凝血性能。分別對空白組、多孔PU薄膜和多孔PU-heparin 薄膜的體外凝血時間進行測定，結果見圖6。由圖6可知，肝素的修飾可以有效延長薄膜的體外凝血時間，賦予材料良好的抗凝血性能[20]。

圖6 多孔PU薄膜和多孔PU-heparin薄膜的 APTT/PT/TT體外凝血時間Fig.6 APTT/PT/TT of porous PU and PU-heparin films

2.5.3 溶血率分析

溶血率也是判斷生物材料血液相容性的重要指標，生物材料必須滿足溶血率<5%。圖7為多孔PU薄膜和多孔PU-heparin薄膜的溶血率結果。由圖7可知：多孔PU薄膜和多孔PU-heparin 薄膜溶血率均遠小于規(guī)定值，因此可以判斷薄膜具有良好的血液相容性能。

圖7 多孔PU薄膜和多孔PU-heparin薄膜的溶血率Fig.7 Hemolysis of porous PU and PU-heparin memberances

2.5.4 紅細胞形態(tài)分析

紅細胞形態(tài)可以直觀地反映材料的安全性能。圖8為與多孔PU薄膜和多孔PU-heparin薄膜共孵化后的紅細胞形態(tài)在光學顯微鏡下的照片。由圖8可知，在PBS溶液中未經處理的紅細胞顯示出正常的凹餅狀結構，而與多孔PU薄膜和多孔PU-heparin 薄膜孵化后，紅細胞未出現(xiàn)形態(tài)學異?，F(xiàn)象和凝集現(xiàn)象，與溶血率結果保持一致。

圖8 光學顯微鏡下的紅細胞形態(tài)照片F(xiàn)ig.8 Optical images of RBCs

2.5.5 補體激活和血小板激活情況分析

通過補體激活和血小板激活測試，可以從分子水平判斷材料的血液相容性。在補體激活過程中，C3a是一個重要的標志物，它在血漿中的濃度可以直接反映補體激活程度。圖9為多孔PU和PU-肝素薄膜的補體激活和血小板激活結果。由圖9(a)可知，多孔PU-heparin 薄膜不會激活補體系統(tǒng)，將來這種材料植入體內由于不會激活補體系統(tǒng)所以不會進一步引發(fā)免疫系統(tǒng)的激活。

血小板激活能夠在體內引起血栓的形成，所以血小板激活實驗是評價與血液接觸材料的一個必要實驗。如圖9(b)所示：相比于陰性對照組，多孔PU-heparin 薄膜組血小板激活率無明顯差異，說明多孔PU-heparin 薄膜展示了良好的生物相容性，避免了在今后的植入應用中可能會引起的凝血級聯(lián)反應及進而引發(fā)的血栓現(xiàn)象。

圖9 與多孔PU和PU-肝素薄膜共孵化后的補體激活(a)和血小板激活情況(b)Fig.9 Complement activation (a) and platelet activation (b) upon interaction of porous PU and PU-heparin films

2.6 細胞活力評價

圖10為多孔PU薄膜材料的細胞活力評價結果。由圖10可見:加入VEGF培養(yǎng)的實驗組吸光值均高于未加入VEGF的實驗組吸光值，原因在于VEGF對HUVECs的生長有很好的促進作用，而且接枝肝素的聚氨酯多孔材料由于對VEGF有更高的裝載量，同時對VEGF有著緩釋作用，這些原因導致了多孔PU-heparin-VEGF薄膜比多孔PU -VEGF薄膜有更高的吸光值。從裝載VEGF的時間上來看，裝載24 h的吸光值也高于裝載2 h的吸光值，說明裝載時間也會對裝載量造成影響。

圖10 細胞活力評價Fig.10 Cell viability evaluation

3 結論

采用熱致相分離法制備了多孔PU薄膜，采用肝素進行多孔PU薄膜的功能化改性，實驗結果表明，與改性前相比，修飾肝素可以賦予多孔PU薄膜優(yōu)異的抗黏附特性，有效延長薄膜的體外凝血時間，降低溶血率，避免紅細胞形態(tài)學異?，F(xiàn)象和凝集現(xiàn)象，同時避免補體激活和血小板激活現(xiàn)象。因此，肝素修飾的多孔PU薄膜展示了良好的生物相容性。此外，進一步采用VEGF對薄膜進行修飾，可以有效提高生物活性涂層的細胞活性，促進細胞增殖，為多孔聚氨酯組織工程材料在新生血管方向的應用提供了新的思路。