陳黛詩(shī) 鄭朝攀 杜甲珺 胡繼良

(深圳市人民醫(yī)院，暨南大學(xué)附屬第二臨床醫(yī)學(xué)院，深圳518020)

腦膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性原發(fā)性腫瘤，占顱腦腫瘤的40%～50%[1]。 其中，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma，GBM)呈高度侵襲性生長(zhǎng)，對(duì)放療、化療不敏感，目前的治療主要是姑息性的，預(yù)后極差，復(fù)發(fā)率高。 未經(jīng)治療的GBM的存活率僅約5個(gè)月。 即使是運(yùn)用手術(shù)、化學(xué)治療、放射治療等輔助療法，中位生存期不超過(guò)14.6個(gè)月[2,3]。膠質(zhì)瘤的預(yù)后好壞與腫瘤的生長(zhǎng)速度和浸潤(rùn)侵襲速度有一定的關(guān)系，因此，研究腦膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)速度和浸潤(rùn)侵襲機(jī)制對(duì)于尋找臨床治療的分子靶點(diǎn),提高患者生存率和延長(zhǎng)生存時(shí)間具有重要的意義。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞，TAMs)主要是外周循環(huán)血液中的單核細(xì)胞，在正常的大腦中主要是小膠質(zhì)細(xì)胞。當(dāng)腦實(shí)質(zhì)存在惡性膠質(zhì)瘤時(shí)，血腦屏障受損，膠質(zhì)瘤細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞因子和趨化蛋白促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞和血液中的巨噬細(xì)胞遷移到腫瘤微環(huán)境中增殖、分化形成TAMs[4-6]。TAMs可以通過(guò)表達(dá)一些生長(zhǎng)因子(如表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)和細(xì)胞因子(如IL-6)等促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，新生血管生成，同時(shí)，抑制微環(huán)境免疫反應(yīng)促進(jìn)腫瘤向周?chē)M織浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[6-8]。因此，TAMs在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中具有重要作用，因此有望成為膠質(zhì)瘤治療的新靶點(diǎn)。

由于膠質(zhì)瘤細(xì)胞快速增殖需要更多的谷胱甘肽(L-Glutathione，GSH)來(lái)應(yīng)對(duì)高水平的氧化傷害，因此，膠質(zhì)瘤細(xì)胞相比正常細(xì)胞表達(dá)更高的谷氨酸反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白xCT[9]。xCT表達(dá)上調(diào)保護(hù)膠質(zhì)瘤細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并且增加了化療(替莫唑胺)的耐藥性[10]。但是關(guān)于xCT在TAMs中的表達(dá)和作用鮮有報(bào)道[11]，因此本研究擬采用熒光免疫染色、熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR，TAMs培養(yǎng)技術(shù)探討在腦膠質(zhì)瘤中TAMs是否通過(guò)xCT表達(dá)促進(jìn)腫瘤的發(fā)展,以及TAMs在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中的作用，為膠質(zhì)瘤的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1一般資料 收集2010～2015年本院經(jīng)手術(shù)后病理證實(shí)的人腦膠質(zhì)瘤組織，組織采集后立即置液氮中長(zhǎng)期保存?zhèn)溆?。膠質(zhì)瘤組織按WHO膠質(zhì)瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ級(jí)16例，Ⅲ級(jí)16例，Ⅳ級(jí)16例。

1.2方法

1.2.1TAMs的分離和培養(yǎng) 手術(shù)切除的新鮮腦膠質(zhì)瘤組織切成碎片,用膠原酶消化，37℃消化 1 h，制成細(xì)胞懸液;40 μm無(wú)菌細(xì)胞過(guò)濾器,形成單細(xì)胞懸液;將懸液離心800 r/min，5 min，棄上清后冷PBS沖洗,用不含血清的 RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞加入T75培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。

1.2.2免疫熒光染色 組織常規(guī)OCT膠包埋切片后，0.3% TritonX-100透化15 min,5%正常羊血清+3%BSA室溫封閉30 min;依次加入xCT羊多克隆抗體(1∶300)和CD68鼠單克隆抗體(濃度1∶300)，4℃孵育過(guò)夜;加FITC標(biāo)記的二抗(1∶1 000),室溫避光孵育;Hoechst33258染核(1∶10 000)，封片，Zeiss熒光顯微鏡觀察、照相；設(shè)對(duì)照組，用PBS代替一抗，其余步驟同上。

1.2.3Real time PCR檢測(cè) 用Trizol提取細(xì)胞和組織總RNA，通過(guò)NanoVueTMPlus分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。 使用SuperScript?III逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。采用LightCycler480全自動(dòng)熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(Roche)檢測(cè)。以GAPDH為內(nèi)參。xCT上游引物5′-CCC AGA TAT GCA TCG TCC-3′,下游引物5′-GCA ACC ATG AAG AGG CAT GT-3′，CD14上游引物5′-GCA ACA CAG GAA TGG AGA-3′；下游引物5′-AGC GAA CGA CAG ATT GAG-3′；CD86上游引物5′-CTT CTC TGC TGC TGT AAC-3′,下游引物5′-CTT CTG CTG TGA CCT AAT ATC-3′；Arg-1上游引物5′-GGC AGA AGT CAA GAA GAA-3′，下游引物5′-GTT GTC AGT GGA GTG TTG-3′;CD209上游引物5′-CAG CAC ATC CTC ACA GAA-3′，下游引物5′-CCA ACA TCC AGT CCT ACC-3′；GAPDH上游引物5′-ATG AGA AGT ATG ACA ACA GCC-3′,下游引物5′-AGT CCT TCC ACG ATA CCA AAG-3′。PCR反應(yīng)條件為：95℃，變性5 min； 94℃,15 s，56℃，30 s，72℃,30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)PCR反應(yīng)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取3次平均。利用公式2-ΔΔCT計(jì)算mRNA水平的相對(duì)變化。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，均數(shù)差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間比較采用SNK法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1xCT和CD68在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá) 通過(guò)免疫熒光染色方法，可以觀察到xCT和CD68均在膠質(zhì)瘤中表達(dá)，并且xCT和CD68在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(WHO°Ⅳ)組織中的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度明顯高于WHO°Ⅱ膠質(zhì)瘤的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度 (圖1)。CD68是小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞特異性分子標(biāo)志物[12]。所以，xCT和CD68共同表達(dá)于膠質(zhì)瘤的小膠質(zhì)細(xì)胞中，隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的增高，陽(yáng)性表達(dá)程度不斷增加，提示二者之間具有相互協(xié)同作用。

圖1 膠質(zhì)瘤中xCT和CD68的表達(dá)(免疫熒光染色，×200)Fig.1 Expression of xCT and CD68 in gliomas(Immunofluorescence staining,×200)Note:Red.xCT positive cells；Green.CD68 positive cells；Blue.Nucleus.

圖2 膠質(zhì)瘤和膠質(zhì)瘤分離得到的TAMs中xCT mRNA表達(dá)水平Fig.2 mRNA levels of xCT in gliomas and gliomas-derived TAMsNote:*.P<0.05.

圖3 膠質(zhì)瘤分離得到的TAMs中M2表型標(biāo)記物(CD14和CD86)和促血管生成因子(Arg-1和CD209) mRNA表達(dá)水平Fig.3 mRNA levels of M2 markers(CD14 and CD86) and pro-angiogenic markers(Arg-1 and CD209) in gliomas-derived TAMsNote:*.P<0.05.

RT-PCR檢測(cè)可見(jiàn)膠質(zhì)瘤組織中和從分離得到的TAMs中xCT mRNA水平與膠質(zhì)瘤分化程度相關(guān) (圖2)，WHO°Ⅳ膠質(zhì)瘤中的xCT mRNA水平比WHO°Ⅰ～°Ⅲ膠質(zhì)瘤和正常腦組織增加(P值均<0.05)。

2.2RT-PCR檢測(cè)TAMs中M2表型標(biāo)記物和促血管生成因子的mRNA表達(dá) 檢測(cè)結(jié)果顯示，TAMs中小膠質(zhì)細(xì)胞M2表型標(biāo)記物CD14和CD86 mRNA表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤惡性程度相應(yīng)地上調(diào)(圖3)。同時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞M2表型標(biāo)記物的上調(diào)提示活化狀態(tài)的TAMs數(shù)目增加，支持TAMs在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)展中的潛在作用。另外，與WHO°Ⅰ～°Ⅲ膠質(zhì)瘤和正常腦組織的TAMs相比，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(WHO°Ⅳ)組織中促血管生成因子Arg-1和CD209 mRNA表達(dá)水平明顯增高(圖3)。

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)是具有獨(dú)立的“免疫特權(quán)”部位，以保護(hù)其重要的功能不受免疫介導(dǎo)的炎癥損傷。小膠質(zhì)細(xì)胞作為CNS主要的免疫應(yīng)答細(xì)胞，在CNS受到損傷和病理過(guò)程中小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮了廣泛的先天和適應(yīng)性免疫作用[13]。在正常生理狀態(tài)下小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息態(tài)，但在一定條件下，尤其在膠質(zhì)瘤中，通過(guò)腫瘤微環(huán)境中一些細(xì)胞因子(如IL-6和IL-10)和表皮生長(zhǎng)因子等作用，靜息態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞能夠向M2型轉(zhuǎn)化，從而顯著地促進(jìn)膠質(zhì)瘤的惡性程度[14-16]。另外，小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量在膠質(zhì)瘤中明顯增加，發(fā)揮著聯(lián)系“免疫特權(quán)”中樞神經(jīng)系統(tǒng)部位和外周免疫系統(tǒng)之間的橋梁作用，與膠質(zhì)瘤細(xì)胞相互作用，這一特性使得它們成為膠質(zhì)瘤免疫治療的潛在候選靶點(diǎn)。

CD68是巨噬細(xì)胞核和小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物，其表達(dá)與腫瘤分化程度相關(guān)[17]。在本研究中，通過(guò)免疫熒光染色也觀察到與分化程度高的膠質(zhì)瘤組織比較，CD68陽(yáng)性TAMs在分化程度差的膠質(zhì)瘤組織中數(shù)量明顯增多。xCT是定位在細(xì)胞胞質(zhì)胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體，通過(guò)攝取胞外胱氨酸、排出胞內(nèi)谷氨酸調(diào)控細(xì)胞代謝和抗氧化應(yīng)激，與腫瘤的生長(zhǎng)分化、浸潤(rùn)和預(yù)后密切相關(guān)[18-20]。更重要的是，xCT在膠質(zhì)瘤中過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了膠質(zhì)瘤對(duì)化療和放療的不敏感性[21,22]。本研究發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中CD68和xCT表達(dá)水平明顯高于分化程度高的膠質(zhì)瘤和正常組織，且xCT與CD68共同表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞。提示在惡性程度高的膠質(zhì)瘤中TAMs數(shù)量明顯增加，xCT表達(dá)水平也隨著膠質(zhì)瘤惡性程度增加而增高。TAMs中xCT表達(dá)增加提示TAMs抗氧化等能力增強(qiáng)，攝取更多的胱氨酸和維持細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平，以保證在腫瘤微環(huán)境缺氧狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。另外，缺氧的腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)更多的TAMs聚集，分泌更多的谷氨酸，促進(jìn)其與膠質(zhì)瘤細(xì)胞之間信號(hào)聯(lián)系，形成膠質(zhì)瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的通道。

本研究發(fā)現(xiàn)TAMs向免疫抑制M2態(tài)轉(zhuǎn)化，TAMs活化程度與膠質(zhì)瘤的分化程度密切相關(guān),可作為膠質(zhì)瘤患者預(yù)后指標(biāo)之一。本研究發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，M2型TAMs表達(dá)明顯上調(diào)的同時(shí)，促血管生成因子的表達(dá)水平也顯著增加。有研究表明，M2型TAMs在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中不能激活T細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)，而通過(guò)分泌多種生長(zhǎng)因子(如VEGF,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子等)、細(xì)胞因子(IL-6和IL-18等)和基質(zhì)金屬蛋白酶等來(lái)上調(diào)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力,促進(jìn)新生血管和淋巴管生成，誘導(dǎo)微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、演變[6,8,23,24]。因此，M2型TAMs在膠質(zhì)瘤中有重要的作用，誘導(dǎo)異常新生血管的形成，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和向周?chē)M織浸潤(rùn)，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)展。

總之，膠質(zhì)瘤組織中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞作為膠質(zhì)瘤微環(huán)境中的重要免疫細(xì)胞，與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及不良預(yù)后密切相關(guān)，如何調(diào)控TAMs為膠質(zhì)瘤的治療預(yù)后提供了新的思路。 其能夠通過(guò)xCT過(guò)表達(dá)，促炎癥因子和促血管生成因子促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)展。腫瘤中M2表型的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞募集與腦膠質(zhì)瘤的不良預(yù)后相關(guān)。