向江艷 詹爐停 趙 敏 張 偉 鄭子崢 夏寧邵

(廈門大學分子疫苗學與分子診斷學國家重點實驗室，廈門大學國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心,廈門361102)

呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus，hRSV或RSV)是一種單股負鏈RNA病毒，屬于副黏液病毒科肺炎病毒屬[1,2]，是引起全球范圍內嬰幼兒下呼吸道感染的主要病原之一，兩周歲以內的嬰幼兒幾乎都感染過RSV[3]。RSV感染后，機體會激發(fā)中和抗體及T細胞免疫反應，兩者均在病毒清除后逐漸衰退，從而導致一生中反復感染RSV[4]。

RSV基因組共有10個基因，編碼11個蛋白[5]，其中L蛋白(Large nucleoprotein)為RSV的RNA聚合酶，包含2 165個氨基酸，分子量為250 kD[6]，是RSV病毒顆粒中最大的蛋白，也是核衣殼的重要組分，P與N[7,8]、L以及M2-1蛋白[9]相結合形成核衣殼；另外，N與P蛋白共定位包涵體，為病毒核酸合成提供場所[10]。目前對RSV L蛋白的結構、結構與功能的關系研究還不夠深入，病毒感染復制過程中RNA合成機制以及核相關蛋白在不同階段的表達情況及相互作用尚無明確闡述。本研究通過對L蛋白進行肽段展示來制備線性表位抗體，為今后病毒感染機制及疫苗研究提供檢測試劑。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑和儀器 大腸桿菌DH5α菌株、293FT和骨髓瘤細胞Sp2/0-Ag14(Sp2/0)、載體pC149-mut(簡稱HBc)與F1代腹水小鼠(本實驗室提供)；6～8周雌性BALB/c小鼠(SPF級)(上海斯萊克公司)；ER2566菌株(NEB公司)；Full-L、GFP質粒及Hep2細胞、RSV A2病毒(美國NIH疫苗研究中心饋贈)；限制性核酸內切酶、T4 DNA連接酶(華美生物工程公司)；Taq-DNA聚合酶、逆轉錄酶AMV和RNasin(Promega公司)；Trizol(Roche公司)；RNaseA、DNase Ⅰ、氨基蝶呤、PEG1500、DAPI、FITC熒光標簽抗抗體及弗氏佐劑(美國Sigma公司)；胎牛血清和小牛血清(Hyclone公司)；細胞培養(yǎng)所用RPMI1640、DMEM、MEM培養(yǎng)基、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸及脂質體Lipofectamine2000(Invitrogen公司)；抗生素(華北制藥)；硝酸纖維素膜(PVDF)(Millipore公司)；質粒小量提取試劑盒和PCR產物膠回收試劑盒(QIAGEN公司)；ELISA相關試劑(北京萬泰公司)；GAM-HRP(晶美公司)；化學發(fā)光底物(Thermo公司)；IPTG(Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(AMRESCO公司)。

CO2培養(yǎng)箱(美國Forma公司)；全濕轉印儀、Power Pac 300多用電泳儀(美國Bio-Rad公司)；Nikon Eclipse80 正置顯微鏡、Nikon coolpix990 數碼相機(日本 Nikon 公司)；酶標儀(奧地利TECAN公司)。

1.2實驗方法

1.2.1肽段設計 從GeneBank中下載RSV-A2 L蛋白(KT992094.1)的基因序列，全長2 165個氨基酸。利用DNAstar軟件對L蛋白進行親疏水性分析，避開α螺旋區(qū)域并選取親水區(qū)與表面區(qū)域肽段(部分截圖如圖1A)，采用15肽展示，相鄰肽段之間5肽重疊的方式(如圖1B)，構建了共161條短肽肽庫。使用Blast分析并確定所有肽段具有呼吸道合胞病毒特異性。

1.2.2基因克隆 肽展示片段的擴增與制備：短肽對應的DNA正負鏈(帶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點)稀釋至10 μmol/L，各取10 μl與30 μl ddH2O混勻。按90℃ 10 min，70℃ 10 min，70℃水中退火至室溫(25℃)步驟，制備目的片段。通過BamHⅠ與EcoRⅠ雙位點酶切、T4連接酶將目的片段重組到HBc149載體上(如圖1C)。

常規(guī)分子生物學操作，如：普通PCR擴增、質粒酶切鑒定、片段與載體酶切、目的片段與載體連接等參考《分子克隆實驗指南》第三版[11]；質粒小量提取、小量DNA片段膠回收參考QIAGEN公司相應試劑盒說明書。

1.2.3蛋白表達純化與復性 從平板上挑選單個DH5α菌落轉移至2 ml的LB(加相應抗生素)液態(tài)培養(yǎng)基，37℃振蕩過夜，再取200 μl加至2 ml的LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩2 h，OD600 nm約為0.6；加入IPTG至0.5 mmol/L，設置溫度梯度誘導4、6或8 h，4℃、10 000 r/min離心4 min收集菌體，裂解液重懸，冰浴超聲破碎菌體；4℃、10 000 r/min離心10 min 后取上清逐滴加入等體積20%或40%飽和硫銨溶液，混勻后靜置20 min，3 000 r/min離心10 min，生理鹽水溶解沉淀。

將上述溶液置PB5.8緩沖體系(16 mmol/L Na2HPO4、184 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl和50 mmol/L EDTA用鹽酸或氫氧化鈉溶液調節(jié)pH為5.8即可)中透析，然后在50～65℃水浴30 min，期間不斷振蕩，至出現蛋白沉淀，4℃、2 000 r/min離心20 min去除沉淀，上清轉移到透析袋中并置PB5.8緩沖體系(體積為上清-蛋白樣品的20倍以上)中透析，每隔3～4 h換新配的透析液，共3次；再將透析液換為PBS,透析全程用磁力攪拌器攪拌，環(huán)境溫度為4℃。最后收集透析袋內的樣品經4℃ 12 000 r/min離心10 min，上清即為目的蛋白的復性液。

1.2.4小鼠免疫與脾臟免疫 免疫方案：選取 6～8周齡BALB/c雌鼠， 2只/組，經背部皮下、四肢肌肉、腹股溝皮下等注射免疫原(純化復性蛋白)。注射前，樣品(100 μg/只)與佐劑等體積混合，用注射器反復吹吸成乳濁液，4℃放置30 min，用酒精棉球消毒小鼠后進行免疫。初免時，使用完全弗氏佐劑(Complete Freund′s adjuvant，CFA)；初免2周后開始第一次加免，使用不完全弗氏佐劑(Incomplete Freund′s adjuvant，ICFA)，此后每周加免一針，共加免4次。在第三、四和五周免疫前對小鼠進行眼球采血，血樣37℃孵育30 min，12 000 r/min離心10 min，上清-20℃保存待檢。上述免疫結束后4～6周進行脾臟免疫：乙醚麻醉小鼠，剖開腹腔外皮取出脾臟，沿脾臟縱向注射100 μg抗原，再用手術針線縫合切口。

圖1 肽段展示、質粒構建與表達Fig.1 Peptide display,construction and expression of plasmidNote:A.Secondary structure analysis of L protein；B.Scheme of peptide display；C.Construction of plasmid

1.2.5細胞融合 在融合之前準備飼養(yǎng)層細胞，將一只年齡為13 d左右的BALB/c小鼠脫頸處死，75%乙醇浸泡5 min消毒。轉移至超凈工作臺，使其腹部朝上，剪開外皮暴露胸腔，取出胸腺，經200目細胞篩研磨后得到胸腺飼養(yǎng)細胞懸液。脾免72 h后，無菌取脾臟制成單細胞懸液與SP2/0細胞融合，采用常規(guī)PEG促融合方法。ELISA檢測融合細胞分泌上清篩選克隆陽性細胞株；有限稀釋法亞克隆細胞株，將陽性孔的細胞轉移到24孔板中，再克隆化到96孔板進行培養(yǎng)，挑選單集落細胞孔重復克隆化直到連續(xù)出現3次以上的單克隆。

1.2.6間接法酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA) 蛋白(重組質?；蜉d體HBc149表達純化蛋白)用CB(0.05 mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液)稀釋至0.5 μg/ml，100 μl/孔加至聚苯乙烯板中，4℃過夜；棄掉液體，PBST(PBS+ 0.05%Tween-20)洗一次，2%牛血清白蛋白(PBS配制)封閉，37℃ 1 h；棄去液體，將適當稀釋比例的小鼠血清或單克隆抗體加入，37℃孵育1 h；PBST洗5次，加入GAM-HRP酶標抗體，37℃孵育1 h，PBST洗5次；顯色液A、B等量混合，37℃反應10～15 min，加終止液(2 mol/L硫酸)，用酶標儀單雙波長450 nm/630 nm測定OD值。

1.2.7蛋白印跡分析(Western blot，WB) 樣品或抗原進行常規(guī)SDS-PAGE電泳[11]，恒流300 mA，90 min將蛋白轉移到硝酸纖維素膜，去離子水漂洗后，用5% 脫脂奶[5 g脫脂奶粉用TN buffer溶解并定容至100 ml，TN buffer(pH8.0)成份：50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl]封閉1 h；去離子水漂洗，用TN稀釋待檢樣品，孵育1 h；TNT(TN中加0.05%Tween-20)洗膜3次，每次5 min；用TN稀釋的GAM-HRP孵育1 h，洗膜后；去離子水漂洗，化學發(fā)光底物流遍膜表面，在ImageQuant LAS 4000化學發(fā)光成像儀上進行成像。

1.2.8單克隆抗體IgG亞類鑒定 按照Thermo scientific公司單克隆抗體分型試劑盒說明書操作。

1.2.9免疫熒光 圓形玻璃片(無菌干凈)鋪入24孔板，每孔加入1×105個Hep2細胞。待細胞貼壁后，RSV A2病毒株以MOI=3感染細胞，36 h后去上清，PBS洗滌；200 μl/孔預冷的4%多聚甲醛，避光10 min；洗滌后，200 μl/孔0.3%Triton X-100，孵育15 min。洗滌后10%山羊血清封閉；一抗稀釋合適梯度孵育1 h，洗滌后避光孵育FITC標記的GAM二抗(PBS稀釋)1 h，PBS洗滌；DAPI(PBS稀釋)避光孵育5 min，PBS洗滌；在載玻片上滴加封片劑(70%甘油，2.5%防淬滅劑)，玻片有細胞面朝下蓋上去，吸取多余液體，用指甲油封閉玻片四周，避光晾干。顯微鏡下觀察，并采集圖像。

1.3統(tǒng)計學處理 核酸序列分析與比較采用Blast軟件和DNAstar軟件；數據做圖采用GraphPad Prism 7.0；圖片處理采用ImageJ及Adobe Photoshop CS6軟件。

2 結果

2.1免疫原制備

2.1.1基因克隆 本研究中，我們選擇L蛋白非疏水區(qū)肽段進行肽段展示，目的片段合成后重組到HBc149載體上，隨后進行質粒轉化及質粒小提。為了減少工作量，我們對菌液PCR體系及程序進行調試，使得目的條帶在500 bp處，并得到了117個陽性克隆。經測序及序列比對，共有102個正確的重組質?？捎糜谙乱徊綄嶒?。

2.1.2重組蛋白表達與純化 將經過鑒定的102個質粒轉化進ER2566菌株感受態(tài)中，加入IPTG使目的蛋白在上清中大量表達，發(fā)現IPTG在誘導溫度為30℃時誘導效果最好。20%和40%飽和硫胺純化蛋白，顯示40%硫胺較好純化目的蛋白(如圖2A)。前期實驗中發(fā)現，硫胺溶液的溫度會影響純化效率。因此，我們對加熱溫度進行調試，分別設置45℃、50℃、55℃和60℃，最后采用55℃為熱處理溫度(如圖2B)。

2.2單克隆抗體的制備

2.2.1小鼠免疫及免后血清分析 重組質粒表達純化后，獲得28種目的蛋白可用于免疫小鼠，免疫方案見圖3A。以Full-L質粒轉染293FT細胞裂解液為樣品進行WB分析，第五周血清結果(如圖3B)，顯示只有L2269、L3935和L4099這3組免疫蛋白的血清有較強陽性條帶(如圖3B)，暗示這些肽段可能是L蛋白的線性表位，能有效刺激機體產生大量L蛋白特異性抗體。ELISA檢測免疫后小鼠血清中針對免疫原的抗體水平，第五周血清的反應性檢測結果以EC50(血清的稀釋倍數)表示(如圖3C)，發(fā)現28種免疫蛋白均能刺激小鼠產生較好的免疫應答。為確認血清反應性，挑選了WB 陽性較強的L3935和L4099兩組血清重復WB檢測，以病毒感染的Hep2細胞裂解液為對照(如圖4)，發(fā)現這兩種免疫原激發(fā)的血清抗體既能與質粒轉染表達的L蛋白反應，也能與天然表達的L蛋白相互作用。

圖2 不同濃度硫銨(A)和熱處理溫度(B)的對比Fig.2 Comparison of different concentrations of Ammon-ium sulphate(A) and temperature of heat treatment(B)Note:P.Precipitate；S.Supernatant.

圖3 小鼠免疫及免疫血清檢測Fig.3 Mouse immunization and serum detectionNote:A.Immunization scheme；B.Western blot；C.Reactivity.

2.2.2L蛋白抗體篩選 根據免疫血清檢測結果，選擇血清反應性與WB陽性較強的L3935和L4099兩組小鼠進行脾臟免疫、融合與單克隆細胞篩選，情況見表1所示，將得到的單克隆細胞分別進行細胞凍存和腹水純化抗體。

2.2.3單克隆抗體鑒定 將11株單克隆抗體進行IgG亞類分型、ELISA檢測EC50(如表2)和單抗性質鑒定與分析(如圖5)。亞類分型結果為：3株IgG1、3株IgG2a、2株IgG2b、3株IgG3，分布均勻，沒有表現亞類偏向性；14A10和9H3的EC50數值較小，分別為0.032 μg/ml和0.093 μg/ml，說明這兩株抗體對相應的免疫原的親和力較強。WB檢測結果顯示：L3935有2株(13G4和14A10)，L4099有3株(2F7、9H3和13G2)WB顯示陽性(如圖5A)；SDS-PAGE分析(如圖5B)可見單克隆抗體的輕、重鏈均單一。

隨后，挑選14A10、9H3兩株單抗進行免疫熒光實驗，對RSV A2感染的Hep2細胞內L蛋白進行定位(如圖6)。藍色為DAPI對細胞核的染色，綠色為GAM-FITC指示L蛋白；結果顯示L蛋白定位于宿主細胞的細胞膜表面、包涵體以及核區(qū)。

圖4 部分血清Western blot分析Fig.4 Western blot of partial serumNote:A.Lysate of cells virus infected；B.Lysate of cells transfected with L plasmid；C.Lysate of Hep2 cells；L.Lysate of 293FT cells transfected with L plasmid；V.Lysate of Hep2 cells RSV A2 infected；GFP.Lysate of 293FT cells transfected with GFP plasmid.

表1融合與篩選情況

Tab.1Summaryoffusionandscreeningconditions

ELISA valueHBc-L-peptideHBcPositive wellsL3935L4099After fusion≥1.0<0.5371001st cloning≥1.0<0.59132nd cloning≥1.0<0.5383rd cloning≥1.0<0.538McAbs38

表211株單抗分型及反應性

Tab.2Subtypesandreactivityof11McAbs

McAbs13E213G414A102F75D89H310C810D610F1012H913G2SubtypeIgG2aIgG3IgG1IgG3IgG2bIgG2aIgG1IgG3IgG2bIgG2aIgG1EC50(μg/ml)0.1410.1410.0322.0320.6120.09345.421.3118.9645.7290.173

圖5 11株單抗WB(A)和SDS-PAGE(B)分析Fig.5 Western blot(A)and SDS-PAGE(B)analysis of 11 McAbsNote :+.Lysate of Hep2 cells RSV A2 infected；-.Lysate of Hep2 cells.

圖6 RSV感染的Hep2細胞內L蛋白定位Fig.6 Localization of L protein in Hep2 cells RSV infected

3 討論

一份全球疾病死亡率分析報告顯示，一周歲以內的兒童死亡約有6.7%是由RSV感染引起的[12]，是僅次于肺炎鏈球菌及副流感嗜血桿菌引起兒童下呼吸道感染死亡的第三大病原體；老年人感染RSV后會出現嚴重的癥狀甚至死亡[13,14]，目前針對RSV感染尚無有效治療及預防措施。而對RSV感染的發(fā)病機制及機體抵抗RSV的免疫機制進一步理解有助于為RSV疫苗的研究提供新的線索、為主動免疫預防RSV的疫苗研發(fā)開拓新的思路，從而有望減輕因RSV造成的全世界范圍內醫(yī)療負擔。L蛋白的研究在RSV感染機制研究中占有重要地位，不可或缺。能用于免疫印跡及免疫熒光實驗的單克隆抗體-14A10和9H3的制備，對RSV L蛋白的結構以及結構與功能的關系研究、RSV的生物學作用以及病毒感染機制研究提供基本實驗檢測材料。

本研究中免疫原制備前期，我們直接選擇表面親水非二級結構區(qū)域進行肽段展示的策略大大減少了不必要的工作量。考慮到基因工程抗原免疫原性較弱，我們采用初免混合完全弗氏佐劑，2周后加強免疫混合不完全弗氏佐劑，每周一次共4針加免的免疫方案；ELISA和WB檢測結合的方式挑選能激發(fā)高親和力血清抗體的免疫原；陽性細胞株篩選過程中，利用“雙抗原篩選”的間接ELISA方法，不僅排除了血清抗體中針對載體HBc149的那部分抗體、避免假陽性的干擾，也大大提高了篩選抗體的準確性。最終獲得11株抗L蛋白單克隆抗體，5株顯示WB陽性條帶，其中14A10和9H3有較好的WB反應性；并免疫熒光實驗對病毒感染后細胞內L蛋白進行定位；免疫熒光實驗中L蛋白定位細胞膜表面可能指示正在出胞的RSV病毒顆粒；有報道顯示RSV L、P及N蛋白和病毒RNA共定位于宿主細胞包涵體內，進行病毒核酸復制與轉錄[7,8,10]。另有報道顯示L蛋白定位于被RSV感染的Hep-2細胞核周包涵體，暗示N、P和L可能與核膜有緊密聯(lián)系[15]；圖拉病毒(Tula virus)聚合酶L蛋白是一種負鏈RNA病毒來源的被描述為核周膜相關的蛋白[16]；而L蛋白在被感染細胞中的核特異性，提示L蛋白可能擁有其他未知功能，為RSV感染機制研究提供了新的信息。