趙福河 焦佰海 焦伯延

272000濟寧市疾病預防控制中心檢驗科（趙福河、焦伯延）；518000深圳市血液中心輸血醫(yī)學研究所（焦佰海）

乙型肝炎病毒 X蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx） 是乙型肝炎病毒 （hepatitis B virus，HBV）X基因編碼的154個氨基酸組成的16.5×103蛋白［1］。HBx蛋白功能廣泛，可通過蛋白相互作用影響細胞增殖、細胞凋亡、細胞浸潤和轉移，在肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關鍵作用［2-4］。

線粒體延長因子G1（mitochondrial elongation factor G1，EFG1）是線粒體蛋白翻譯系統(tǒng)的延長因子，控制線粒體氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）過程的I、III、IV和V等 4種復合體的13種蛋白的翻譯［5-6］。這13種蛋白包括NADH脫氫酶 1（ NADH dehydrogenase 1，ND1）、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6、細胞色素 b（ cytochrome B，CYB）、細胞色素 C 氧化酶 I（cytochrome C oxidase I，COX1）、COXII、COXIII、ATP 合成酶 6（ATP synthase 6，ATP6）和 ATP8［5］。 研究表明，ND5、ND6、COXI和ATP8等蛋白在HBV相關肝癌患者中均發(fā)生不同程度的基因變異［7-8］；此外，在HBV相關肝癌患者組織中 ND6、CYB、COX1、ATP6 的表達均降低［9］。然而，4種復合體的13種蛋白在HBV相關肝癌患者中發(fā)生改變的具體機制及對肝細胞癌的影響尚未闡明。

本研究構建真核表達載體pcDNA3.1／myc-His（-）A-EFG1，在Huh7肝癌細胞中共表達 HBx蛋白與EFG1蛋白后，HBx蛋白與EFG1蛋白可以發(fā)生直接相互作用。為進一步闡明HBV致病機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑 CytoTrap酵母雙雜交試劑盒（批號：217438）購自 Stratagene公司；TaqDNA Polymerase High Fidelity（批號：11304-011）、pcDNA3.1／myc-His（-）A 載體（批號：V855-20）、Anti-myc（批號：46-0603）和 Lipofectamine 2000（批號：11668-019）均購自Invitrogen公司；限制性內切酶 Xba I（批號：1093 A）、Hin dIII（批號：1060 A）和 T4DNA 連接酶（批號：2011 A）均購自 TaKaRa公司；Anti-FLAG（批號：1346 V） 購自 Sigma公司；Protein A＆G Agarose（批號：sc-2003）購自 Santa Cruz公司；Western及 IP細胞裂解液（批號：P0013）購自碧云天生物科技有限公司；pENTER-EFG1（批號：CH-891028） 購自維真生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CytoTrap酵母雙雜交驗證HBx蛋白與EFG1蛋白相互作用：參照CytoTrap操作說明書，將pMyr-EFG1和 pSos-HBx、pMyr-EFG1 和 pSos MAFB、pMyr-EFG1和pSosColI各300 ng分別共轉化到cdc25Hα酵母，分別涂布于SD／Glucose（-UL）固體培養(yǎng)基，24℃培養(yǎng)4 d后，分別挑選3個克隆于50μl SD／Glucose（-UL）液體培養(yǎng)基，充分混勻后，取出4μl分別到2個SD／Glucose（-UL）固體培養(yǎng)基和2個SD／Galactose（-UL）固體培養(yǎng)基；其中1 個 SD／Glucose（-UL）和1個 SD／Galactose（-UL）固體培養(yǎng)基放在24℃培養(yǎng)4 d；另外1個 SD／Glucose（-UL）和1個 SD／Galactose（-UL）固體培養(yǎng)基放在37℃培養(yǎng)4 d。另外共轉化pSos MAFB和pMyr MAFB、pSos MAFB和pMyr SB為CytoTrap酵母雙雜交系統(tǒng)陽性對照；共轉化pSos MAFB和pMyrLamin C、pSos Col I和pMyr MAFB為CytoTrap酵母雙雜交系統(tǒng)陰性對照。

cdc25Hα酵母24℃時，酵母 Sos蛋白功能正常，酵母可以正常生長；但37℃時，酵母Sos蛋白功能異常，酵母不生長，然而如果HBx蛋白與EFG1蛋白（Gal誘導pMyr-EFG1載體EFG1蛋白在酵母中表達；Gal培養(yǎng)基上EFG1蛋白可以表達，并定位于細胞膜；但Glu培養(yǎng)基上EFG1蛋白不表達）相互作用，就可將pSos-HBx載體表達的Sos蛋白募集在酵母細胞膜上，37 ℃酵母可在 SD／Galactose（-UL）固體培養(yǎng)基生長；如HBx蛋白與EFG1蛋白不發(fā)生相互作用，37 ℃酵母在 SD／Galactose（-UL）固體培養(yǎng)基不生長。

1.2.2 pcDNA3.1／myc-His（-）A-EFG1 真核表達載體的構建：以pENTER-EFG1為模板，使用上游引物： 5′-GCTCTAG AATGAGACTCCTGGGAGCTGCA-3′（下劃線為 Xba I位點）和下游引物：5′-CCCAAG CT TGTTCTTGGCTTTTCCTTT-3’（下劃線為 Hin dIII位點），PCR 擴增 EFG1（NM＿024996）全長基因片段，以Xba I和Hin dIII酶切位點克隆于pcDNA3.1／myc-His（-）A載體。 重組載體經 Xba I和 Hin dIII雙酶切鑒定并經測序證實目的基因正確無誤，命名為pcDNA3.1／myc-His（-）A-EFG1。

1.2.3 HBx蛋白和EFG1蛋白在Huh7細胞中的表達：每孔接種50萬Huh7細胞于6孔板，觀察24 h后，pcDNA3.1／myc-His（-） A-EFG1 載 體、FLAGCMV-2-HBx載體各1μg分別轉染Huh7細胞，另外轉染 pcDNA3.1／myc-His（-）A、pFLAG-CMV-2 各 1 μg作為對照，48 h后，Western blot及IP細胞裂解液提取細胞總蛋白，經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后電轉移至PVDF膜上。Western blot檢測采用的一抗是與目的蛋白融合表達的標簽抗體，即Anti-myc或Anti-FLAG單克隆抗體（1∶1 000），封閉液、二抗、洗液及檢測系統(tǒng)均采用WESTERNBREEZE試劑盒，操作按照試劑說明書進行。

圖1 CytoTrap酵母雙雜交法驗證HBx蛋白與EFG1蛋白相互作用Fig.1 Confirmation of the interaction between HBx and EFG1 by the CytoTrap two-hybrid assay

1.2.4 免疫共沉淀驗證HBx蛋白與EFG1蛋白的相互作用：將300萬Huh7細胞接種10 cm細胞平板，24 h 以后，共轉染 pcDNA3.1／myc-His（-）AEFG1載體和pFLAG-CMV-2-HBx載體各5μg，另外共轉 染 pcDNA3.1／myc-His（-） A-EFG1 載 體 和pFLAG-CMV-2載體各5μg作為對照組。48 h后，Western blot及IP細胞裂解液裂解細胞30 min，取上清，分別加入 20 μl Protein A＆G Agarose、5 μg Anti-FLAG 和20 μl Protein A＆G Agarose、5 μg Antimyc抗體，4℃，5.6×10-3g，半徑5 cm垂直旋轉孵育過夜后，收集Protein A＆G Agarose，加入20μl 2×SDS蛋白上樣緩沖液，經10%SDS-PAGE電泳后電轉移至 PVDF膜上，分別用 Anti-myc（1∶1 000）和Anti-FLAG（1∶1 000）檢測。

2 結果

2.1 CytoTrap酵母雙雜交法證明HBx蛋白與EFG1蛋白相互作用 相互作用驗證組和兩組CytoTrap酵母雙雜交系統(tǒng)陽性對照pMyr-EFG1和pSos-HBx、pSos MAFB 和 pMyr SB、pSos MAFB 和pMyr MAFB分別共轉化到cdc25Hα酵母后，酵母在SD／Glucose（-UL）和 SD／Galactose（-UL）固體培養(yǎng)基24℃可生長，在SD／Glucose（-UL）固體培養(yǎng)基37℃不生長，但在 SD／Galactose（-UL）固體培養(yǎng)基37℃可以生長。而兩組陰性對照和兩組CytoTrap酵母雙雜交系統(tǒng)陰性對照pMyr-EFG1和pSos MAFB、pMyr-EFG1和pSosColI、pSos MAFB 和 pMyrLamin C、pSos Col I和pMyr MAFB分別共轉化到cdc25Hα酵母后，酵母在 SD／Glucose（-UL）和 SD／Galactose（-UL）固體培養(yǎng)基24℃可生長，在SD／Glucose（-UL）固體培養(yǎng)基和SD／Galactose（-UL）固體培養(yǎng)基37℃均不生長（圖1）。結果說明HBx蛋白與EFG1蛋白發(fā)生了相互作用。

2.2 pcDNA3.1／myc-His（-）A-EFG1 重組載體的鑒定 EFG1基因全長2 253 bp，編碼751個氨基酸的蛋白，相對分子質量約為83.5×103。PCR擴增EFG1基因片段，克隆入真核表達載體pcDNA3.1／myc-His（-）A，構建 pcDNA3.1／myc-His（-）A-EFG1重組載體，經Xba I和Hind III雙酶切，鑒定正確，并測序證實目的基因正確無誤。

2.3 pcDNA3.1／myc-His（-） A-EFG1 和 p FLAGCMV-2-HBx重組載體在細胞中表達鑒定 在pcDNA3.1／myc-His（-）A-EFG1 重組載體中，目的蛋白EFG1與載體編碼的myc多肽（10個氨基酸，可被相應的抗體檢出）融合表達，編碼融合蛋白相對分子質量大約83.5×103。將 pcDNA3.1／myc-His（-）A-EFG1 載體和對照載體 pcDNA3.1／myc-His（-）A分別轉染到Huh7細胞中，提取細胞蛋白，用myc抗體Western blot檢測，結果顯示在相應相對分子質量處可檢測到特異性條帶，確定融合蛋白已經表達（圖2）。

1：轉染 pcDNA3.1／myc-His（-） A；2：轉染 pcDNA3.1／myc-His（-） A-EFG；3： 轉 染 pFLAG-CMV-2；4： 轉 染pFLAG-CMV-2-HBx圖2 Western blot檢測EFG1-myc和FLAG-HBx融合蛋白在Huh7細胞中的表達1： pcDNA3.1／myc-His （-） A were transfected； 2：pcDNA3.1／myc-His（-） A-EFG1； 3： pFLAG-CMV-2 were transfected；4： pFLAG-CMV-2-HBx were transfectedFig.2 Western blot analysis of EFG1-myc and FLAG-HBx fusion protein expressed in Huh7 hepatocytes

此外，在pFLAG-CMV-2-HBx重組載體中，目的蛋白HBx與載體編碼的FLAG多肽（8個氨基酸，可被相應的抗體檢出）融合表達，編碼蛋白分子質量大約16.5×103。將 pFLAG-CMV-2-HBx載體和對照載體pFLAG-CMV-2分別轉染到Huh7細胞中，提取細胞蛋白，用FLAG抗體Western blot檢測，結果顯示在相應分子量處可檢測到特異性條帶，確定融合蛋白已經表達（圖2）。

2.4 免疫共沉淀確證HBx與EFG1蛋白的相互作用 為了確證HBx蛋白和EFG1蛋白在肝細胞內的相 互 作 用， pcDNA3.1／myc-His（-） A-EFG1 和pFLAG-CMV-2-HBx共轉染Huh7細胞，另外共轉染pcDNA3.1／myc-His（-）A-EFG1 和 pFLAG-CMV-2 作為陰性對照，48 h后提取蛋白，用Anti-FLAG偶聯(lián)的Protein A＆G Agarose進行免疫沉淀，用Anti-myc進行Western blot檢測，發(fā)現FLAG-HBx蛋白可以把EFG1-myc沉淀下來（圖3）。

此外，用 Anti-myc偶聯(lián)的Protein A＆G Agarose進行免疫沉淀，用Anti-FLAG進行 Western blot檢測，發(fā)現EFG1-myc蛋白可以把FLAG-HBx沉淀下來（圖3）。說明HBx蛋白和EFG1蛋白的相互作用在細胞內確實存在。

3 討論

1、3：轉染 pcDNA3.1／myc-His（-）A-EFG1 和 pFLAG-CMV-2；2、4：轉染 pcDNA3.1／myc-His（-） A-EFG1 和 pFLAG-CMV-2-HBx圖3 免疫共沉淀確證HBx與EFG1蛋白的相互作用1， 3： pcDNA3.1／myc-His（-）A-EFG1 and pFLAG-CMV-2 were transfected； 2， 4： pcDNA3.1／myc-His（-）A-EFG1 and pFLAGCMV-2-HBx were transfectedFig.3 Co-IPassay of the interaction between HBx and EFG1

CytoTrap酵母雙雜交是一種經改進準確、高效的酵母雙雜交方法，主要優(yōu)點是研究的蛋白經過翻譯后修飾，檢測的相互作用發(fā)生在細胞質，更適合于研究具有轉錄功能的蛋白，隨著酵母雙雜交方法不斷改進，假陽性率逐漸降低。免疫共沉淀技術是驗證蛋白質之間特異性相互作用的一種經典方法，其研究的蛋白相互作用是細胞內自然存在的相互作用蛋白復合體，是驗證蛋白相互作用的極為有效的可信方法。本研究利用CytoTrap酵母雙雜交篩選與HBx蛋白相互作用肝細胞蛋白，獲得1個新的蛋白即EFG1，并經CytoTrap酵母雙雜交和免疫共沉淀方法進一步證明HBx蛋白與EFG1蛋白存在直接相互作用。目前，國內外尚無HBx蛋白與EFG1蛋白相互作用的報道。

HBx蛋白在HBV誘發(fā)的HCC過程中發(fā)揮關鍵作用，HBx蛋白能夠直接結合并抑制P53蛋白進而促進細胞增殖并誘導腫瘤的發(fā)生［10］；HBx蛋白能夠通過活化核因子-κB、無翅型MMTV整合位點家族、缺氧誘導因子-1α、轉化生長因子-β等多種信號通路影響細胞周期蛋白-D1、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、IL-8等多種腫瘤相關基因的表達，促進肝細胞腫瘤的增殖、侵襲和轉移［11-12］；HBx蛋白可通過增強Bcl2關聯(lián)X蛋白蛋白轉位到線粒體、促進活性氧簇的產生、抑制Bcl-2樣蛋白1表達等多種線粒體途徑誘導肝細胞凋亡［10，13］。 此外，HBx 蛋白不改變核編碼的OXPHOS過程相關蛋白表達，但可以通過特異下調線粒體DNA翻譯控制的I、III、IV、V 4種復合體相關蛋白的表達，抑制OXPHOS，促進肝細胞凋亡［14］。

EFG1蛋白是線粒體DNA翻譯的關鍵因子，肝臟EFG1蛋白異常，將阻礙線粒體DNA編碼的13種蛋白合成，導致 I、III、IV、V 4種復合體的活性降低、OXPHOS抑制及能量代謝缺陷，引發(fā)肝臟功能障礙［15-17］ 。

HBx蛋白不改變 COXIII的 mRNA 含量［18］，但可以改變COXIII等線粒體DNA翻譯的蛋白表達［14］，但是至今仍未有相關機制的研究；在HBV相關肝癌患者組織中線粒體DNA翻譯的蛋白表達降低［9］，而具體原因仍無研究報道。本研究將為探討HBx蛋白可能通過直接結合EFG1蛋白影響線粒體蛋白翻譯系統(tǒng)，導致線粒體DNA翻譯的蛋白表達降低、OXPHOS抑制、肝細胞凋亡，引發(fā)肝細胞癌并導致HBV相關肝癌患者中線粒體DNA翻譯蛋白的降低提供研究依據。但是，本研究僅進行了HBx蛋白與EFG1蛋白相互作用的初步研究，而HBx蛋白通過EFG1蛋白對線粒體DNA翻譯的影響和對HCC發(fā)生發(fā)展的影響仍未清楚，目前相關研究正在進行之中。

利益沖突無