張 樂(lè)，寧 越，李佩韋，王洪寶，2，昝林森，2*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 712100； 2. 國(guó)家肉牛改良中心，楊凌 712100)

牛肉不僅肉質(zhì)鮮美，而且具有高蛋白、低脂肪和低膽固醇等特點(diǎn)，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值遠(yuǎn)高于其他肉類[1]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平提高，牛肉供不應(yīng)求，提高牛肉的產(chǎn)量和品質(zhì)是迫在眉睫的問(wèn)題[2]。一系列的研究表明，畜禽的產(chǎn)肉性能和肉品質(zhì)離不開(kāi)對(duì)骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育及肌內(nèi)脂肪含量的研究。TGF-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號(hào)通路調(diào)控了間充質(zhì)干細(xì)胞的分化，抑制了脂肪細(xì)胞和成肌細(xì)胞的分化[3-5]。而Smad蛋白家族是將TGF-β與其受體結(jié)合后產(chǎn)生的信號(hào)從細(xì)胞膜傳導(dǎo)到細(xì)胞核的重要中介分子。目前，Smad共分為3個(gè)不同的亞族：受體激活型Smads(receptor-activated Smad，R-Smad)主要包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8和Smad9，可將TGF-β信號(hào)直接從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞核內(nèi)；共同通路型Smad(common Smad, C-Smad)即Smad4；抑制型Smads(inhibitory Smads, I-Smad)主要包括Smad6、Smad7[6-7]。Smad2/Smad3屬于R-Smad，是TGF-β信號(hào)通路的直接作用底物，更是信號(hào)下傳的第一個(gè)信號(hào)分子。而目前已有研究證明，在TGF-β1抑制成肌分化過(guò)程中起關(guān)鍵作用的是Smad3而非Smad2，同時(shí)Smad3表達(dá)水平的上調(diào)可抑制成肌調(diào)節(jié)因子的表達(dá)[8-9]。

目前對(duì)Smad3基因的研究主要是集中在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育時(shí)期以及出生后肌肉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的調(diào)節(jié)，但其在成脂調(diào)控中的作用鮮有報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1抑制脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制主要是通過(guò)與Smad3和Wnt /β-catenin信號(hào)通路之間的交流，從而下調(diào)了PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor γ)的表達(dá)[10]?！半p肌臀基因”肌肉抑制素(Myostatin)是TGF-β1家族成員之一，在機(jī)體內(nèi)主要擔(dān)任負(fù)調(diào)節(jié)作用。研究證明，MSTN抑制骨骼肌細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制褐色脂肪細(xì)胞分化和降低白色脂肪褐色化主要是通過(guò)調(diào)控Smad3基因控制的β-catenin的積累[11-12]。視黃素抑制脂肪細(xì)胞分化時(shí)，也需要與Smad3基因結(jié)合共同起作用[13]。這些研究表明，Smad3基因在脂肪和肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中都起著負(fù)調(diào)控作用。

鑒于Smad3基因的重要功能，以及應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)技術(shù)以實(shí)現(xiàn)對(duì)秦川牛前體脂肪細(xì)胞的高效侵染和持續(xù)表達(dá)來(lái)研究該基因的功能尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以秦川牛脂肪組織為試驗(yàn)材料，克隆秦川牛Smad3基因，構(gòu)建了腺病毒過(guò)表達(dá)載體和重組干擾腺病毒載體，并獲得了對(duì)秦川牛前體脂肪細(xì)胞Smad3有過(guò)表達(dá)能力的腺病毒AD-bSmad3和具有干擾能力的腺病毒AD-ShRNA-bSmad3，研究其對(duì)秦川牛前體脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究該基因和TGF-β信號(hào)通路在秦川牛脂肪組織生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

18月齡秦川牛的脂肪組織采自國(guó)家肉牛改良中心；pDC316-mCMV-EGFP、pDC316-EGFP-ShRNA載體質(zhì)粒、JM109感受態(tài)細(xì)胞、Polyfectine購(gòu)自深圳百恩維生物科技有限公司；小量質(zhì)粒抽提試劑盒、Trans2K Plus II DNA Marker購(gòu)自北京全式金生物公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；限制性內(nèi)切酶NotⅠ、NheⅠ，T4 DNA Ligase購(gòu)自美國(guó)NEB公司；Qiagen大規(guī)模質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、胰蛋白酶Trypsin 0.25% EDTA購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；青鏈霉素雙抗購(gòu)自Gibco；ViraBind腺病毒純化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cell Biolabs公司；SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)購(gòu)自寶生物工程有限公司(TaKaRa)。

1.2 重組腺病毒載體的構(gòu)建

以秦川牛脂肪組織反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，根據(jù)GenBank公布的牛Smad3(GenBank accession NO.: NM_001205805)基因序列為參考，設(shè)計(jì)引物見(jiàn)表1，并在上、下游引物分別添加NheⅠ 和NotⅠ 酶切位點(diǎn)，用Fastpfupolymerase高保真酶擴(kuò)增Smad3基因完整的CDS區(qū)，反應(yīng)體系(50 μL)：DNA模板(100 ng·μL-1) 1 μL，F(xiàn)astpfupolymerase 1 μL，5× Fastpfubuffer 10 μL，dNTP Mix (2.5 mmol·L-1) 4 μL，上下游引物各(10 μmol·L-1)2 μL，ddH2O 30 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸75 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃冷卻10 min。膠回收酶切產(chǎn)物后再與穿梭質(zhì)粒pDC316-mCMV-EGFP連接，穿梭載體pDC316-mCMV-EGFP酶切體系(20 μL)：10×Buffer 2 μL，10×BSA 2 μL，NheI和NotI各1 μL，質(zhì)粒(500 ng·μL-1)2 μL，ddH2O 12 μL。目的基因bSmad3酶切體系(20 μL)：10×Buffer 2 μL，10×BSA 2 μL，NheI和NotI各1 μL，PCR回收產(chǎn)物10 μL，ddH2O 4 μL。連接體系(10 μL)：pDC316-mCMV-EGFP質(zhì)粒2 μL，bSMAD3 6.5 μL，10×DNA Ligase Buffer 1 μL，T4DNA Ligase 0.5 μL。用攜帶目的基因的重組質(zhì)粒pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3以及骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞，獲得攜帶目的基因Smad3的過(guò)表達(dá)腺病毒pDC316-EGFP-bSMAD3，標(biāo)記為AD-bSMAD3；同時(shí)用重組質(zhì)粒pDC316-EGFP做對(duì)照組病毒，標(biāo)記為AD-NC。

以牛Smad3(GenBank accession NO.:NM_001205805)基因序列為模板，應(yīng)用shRNA在線設(shè)計(jì)軟件共設(shè)計(jì)3條特異shRNA，根據(jù)其靶向定位在Smad3基因CDS區(qū)的位置依次命名為shRNA-1247、shRNA-1405、shRNA-1486，經(jīng)退火復(fù)性后克隆入穿梭質(zhì)粒pDC316-EGFP-ShRNA 中。通過(guò)干擾效率檢測(cè)后，選擇pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405與骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞進(jìn)行同源重組，獲得重組干擾腺病毒載體pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405，標(biāo)記為AD-ShRNA-bSMAD3；同時(shí)用重組質(zhì)粒pDC316-EGFP-ShRNA做對(duì)照組病毒，標(biāo)記為AD-ShRNA-NC。

表1PCR引物序列

Table1PrimersforPCR

基因Gene引物序列(5'→3')Primer sequence產(chǎn)物大小/bp LengthGenBank登錄號(hào)GenBank accession No.Smad3(CDS)F-CTAGCTAGCCACCATGTCGTCCATCCTGCCTTTCACR-ATTTGCGGCCGCCTACAGATCCTCTTCTGAGATGA-GTTTTTGTTCC1 332NM_001205805Smad3(ShRNA-1405)F-GCATGTGCACCATTCGCATGATTCAAGAGATC-ATGCGAATGGTGCACATGCTTTTTTAGATCTGR-GATCCAGATCTAAAAAAGCATGTGCACCATTCGC-ATGATCTCTTG-AATCATGCGAATGGTGCACATGC600NM_001205805

1.3 重組腺病毒的包裝、擴(kuò)增及滴度測(cè)定

取鑒定好的重組病毒質(zhì)粒4 μg，用Polyfectine將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293A細(xì)胞,將細(xì)胞置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4～6 h后換液。待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合后，傳代于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每天觀察，待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合后，傳代于75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每天觀察出毒跡象，即細(xì)胞收縮變圓并伴隨有細(xì)胞脫落。待細(xì)胞大部分病變并從培養(yǎng)瓶壁脫落后，進(jìn)行收毒，為病毒母液P1。用P1病毒上清感染293A細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞收縮變圓并伴隨有細(xì)胞脫落時(shí)收集細(xì)胞，-80 ℃/37 ℃反復(fù)凍融3次，10 000 g離心10 min收集病毒上清，標(biāo)記為P2；用同樣的方法擴(kuò)增病毒至P4代；用腺病毒純化試劑盒純化P4代病毒。用LaSRT法測(cè)定病毒滴度。

1.4 秦川牛前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)及腺病毒感染細(xì)胞最佳MOI值測(cè)定

復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)室冷凍保存的秦川牛第1代前體脂肪細(xì)胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)后，將細(xì)胞按1×104個(gè)·孔-1接種于兩個(gè)24孔培養(yǎng)板中。前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)基為DMEM/F-12、10% FBS。分別加入不同劑量的腺病毒(感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)分別為25、50、75、100、125和150)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，48 h后根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及綠色熒光的表達(dá)情況來(lái)確定最佳的感染濃度。

1.5 腺病毒侵染秦川牛前體脂肪細(xì)胞

復(fù)蘇秦川牛第1代前體脂肪細(xì)胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)到第3代時(shí)，將細(xì)胞按2×105個(gè)·孔-1接種于6孔培養(yǎng)板中，使用未誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(10%FBS+F12)培養(yǎng)。試驗(yàn)共設(shè)計(jì)4個(gè)處理組：AD-bSMAD3、AD-NC、AD-ShRNA-bSMAD3、AD-ShRNA-NC。待前體脂肪細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)，按照MOI值添加腺病毒原液，12 h后換成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(0.25 mmol·L-1IBMX、1 μmol·L-1地塞米松和5 μg·mL-1胰島素)的完全培養(yǎng)液；2 d后，撤去IBMX和地塞米松，使完全培養(yǎng)液中只含有5 μg·mL-1胰島素；再2 d后換成脂肪細(xì)胞完全培養(yǎng)基，每2 d換液1次。分別在培養(yǎng)的第0、3、6、9天時(shí)收集細(xì)胞，提取RNA并進(jìn)行油紅O染色。

1.6 秦川脂肪細(xì)胞油紅O染色

從培養(yǎng)箱中取出侵染腺病毒6 d的脂肪細(xì)胞，先棄去培養(yǎng)基，用PBS洗3次，再用4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS清洗3次。用油紅O工作液(0.5 g的油紅O染液，加入100 mL的異丙醇，37 ℃振蕩混勻過(guò)夜為原液，使用時(shí)按照雙蒸水與原液比例為2∶3的比例進(jìn)行稀釋并過(guò)濾)在室溫下浸染細(xì)胞30 min，PBS清洗3次；在顯微鏡下觀察照相。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因的表達(dá)

用Trizol試劑提取轉(zhuǎn)染Smad3基因第0、3、6、9天的前體脂肪細(xì)胞總RNA。各取1 μg RNA，按TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，利用ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀使用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)總體系為20 μL。檢測(cè)Smad3基因及成肌和成脂相關(guān)基因的表達(dá)。定量引物相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表2。反應(yīng)體系(20 μL)：2 × SYBR Premix Ex Taq Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，cDNA(<100 ng)2 μL，ROX Reference Dye II (50×Conc.) 0.4 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性12 s，60 ℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性3 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。

表2定量引物序列

Table2PrimersforReal-timePCR

基因Gene引物序列(5'→3')Primer sequence產(chǎn)物/bpLengthGenBank登錄號(hào)GenBank accession No.Smad3F-AGCTGACACGGAGGCATATCR-CAGTTGGGAGACTGCACAAA109NM_001205805PPARγF-GAGATCACAGAGTACGCCAAGR-GGGCTCCATAAAGTCACCAA216NM_181024FABP4F-TGAGATTTCCTTCAAATTTGGGR-CTTGTACCAGAGCACCTTCATC101NM_174314C/EBPαF-ATCTGCGAACACGAGACGR-CCAGGAACTCGTCGTTGAA73NM_176784C/EBPβF-TTCCTCTCCGACCTCTTCTCR-CCAGACTCACGTAGCCGTACT79NM_176788GAPDHF-CCAACGTGTCTGTTGTGGATR-CTGCTTCACCACCTTCTTGA80NM_001034034β-actinF-CATCGGCAATGAGCGGTTCCR-ACCGTGTTGGCGTAGAGGTC147NM_173979.3

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)”表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，用t檢驗(yàn)(t-test)對(duì)不同試驗(yàn)處理之間的差異進(jìn)行顯著性分析。*表示P<0.05，**表示P<0.01,***表示P<0.001。

2 結(jié) 果

2.1 秦川牛Smad3基因過(guò)表達(dá)腺病毒載體的構(gòu)建

以脂肪組織cDNA為模板，設(shè)計(jì)Smad3基因PCR引物擴(kuò)增CDS全長(zhǎng)，瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，其目的條帶單一，大小為1 332 bp(圖1A)。瓊脂糖凝膠回收目的片段與pDC316-mCMV-EGFP連接，構(gòu)建Smad3基因過(guò)表達(dá)腺病毒載體pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3，用NheI和NotI雙酶切檢測(cè)并測(cè)序，雙酶切得到2條條帶，大小分別是1 332和5 885 bp(圖1B)。同時(shí)測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)得到的秦川牛Smad3基因序列與GenBank收錄序列一致，證明過(guò)表達(dá)腺病毒載體pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3構(gòu)建成功。

2.2 秦川牛Smad3基因干擾腺病毒載體的構(gòu)建

shRNA-1247、shRNA-1405、shRNA-1486經(jīng)退火復(fù)性后克隆入穿梭質(zhì)粒pDC316-EGFP-ShRNA中。通過(guò)在HEK293A細(xì)胞中干擾效率檢測(cè)后，結(jié)果表明，pENTR/CMV-GFP/U6-1247、pENTR/CMV-GFP/U6-1405和pENTR/CMV-GFP/U6-1486均具有干擾效果，干擾效率分別為76.9%、83.3%、78.3%，其中pENTR/CMV-GFP/U6-1405的干擾效果相對(duì)較好(圖2A)，因此選擇shRNA-1405作為

最終使用的干擾序列，并構(gòu)建重組腺病毒干擾載體pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405。用BglⅡ做酶切鑒定，在載體骨架上含有一個(gè)BglⅡ酶切位點(diǎn)，結(jié)合片段上的BglⅡ位點(diǎn)可切出600 bp的條帶(圖2B)。

M1. DL2000相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；M2. Trans2K plus marker DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. PCR擴(kuò)增秦川牛Smad3基因產(chǎn)物；2. pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3質(zhì)粒Nhe Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切鑒定結(jié)果M1. DL2000 marker； M2. Trans2K plus marker; 1. Agarose gel electrophoresis of Smad3 gene PCR products; 2. Digestion identification of pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3 plasmid by Nhe Ⅰ and Not Ⅰ圖1 Smad3基因克隆及pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.1 Cloning of Smad3 gene and enzyme digestion identification of pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3

A. Smad3有效干擾shRNA序列的篩選(干擾效率為76.9%、83.3%、78.3%，**表示P<0.01)；B. pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405質(zhì)粒Bgl Ⅱ酶切鑒定：M. Trans2K plus marker DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405質(zhì)粒Bgl Ⅱ酶切鑒定結(jié)果A. Inhibitive efficiency of Smad3 selective shRNA(Inhibitive efficiency is 76.9%, 83.3%, 78.3%; ** indicate P<0.01); B. Digestion identification of pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405 plasmid by Bgl Ⅱ: M. Trans2K plus marker； 1. The result of digestion identification of pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405 plasmid by Bgl Ⅱ圖2 Smad3基因干擾腺病毒載體的構(gòu)建Fig.2 The construction of Smad3 shRNA adenovirus vectors

2.3 重組腺病毒的包裝、擴(kuò)增及滴度測(cè)定

用攜帶目的基因的重組質(zhì)粒pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3以及骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞1 d后即可觀察到綠色熒光；9 d后綠色熒光蛋白的表達(dá)量增多，并開(kāi)始聚集形成彗星狀，12 d后大部分細(xì)胞出現(xiàn)病變效應(yīng)并從培養(yǎng)瓶壁脫落，此時(shí)收集的病毒即為病毒母液P1(圖3A～3C和4A～4C)。第3代純化后的腺病毒感染細(xì)胞僅24 h，就有約50%的細(xì)胞出現(xiàn)病變現(xiàn)象，此時(shí)收集的病毒即為具有較高滴度的第4代腺病毒(圖3D和4 D)。采用LaSRT法測(cè)定滴度時(shí)，24 h后在顯微鏡下觀察細(xì)胞的綠色熒光蛋白(圖3E和4 E)，計(jì)算出腺病毒的滴度均為1×1010PFU·mL-1。用同種方法得到AD-NC、AD-ShRNA-bSMAD3、AD-ShRNA-NC的腺病毒滴度均為1×1010PFU·mL-1。

A.病毒重組子轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞24 h綠色熒光情況觀察；B.轉(zhuǎn)染9 d綠色熒光形成彗星狀的熒光聚集現(xiàn)象；C.轉(zhuǎn)染12 d綠色熒光變亮并鋪滿整個(gè)視野，大量細(xì)胞變圓脫壁，形成空斑；D.高滴度病毒侵染HEK293A細(xì)胞24 h綠色熒光分布情況；E.病毒原液分別稀釋102、103、104、105、106、107、108、109倍A. Fluorescence microscopic image of HEK293A cells transfected after 24 h; B. Fluorescence microscopic image after 9 d adenovirus transfection; C. Cytopathic effect (CPE) after 12 d adenovirus transfection; D. Fluorescence microscopic image after high titer adenovirus transfection for 24 h; E. The virus was diluted 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 and 109 times圖3 過(guò)表達(dá)重組腺病毒的包裝及病毒滴度測(cè)定Fig.3 Overexpression recombinant adenovirus packaging and their titer determining

2.4 秦川牛前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)及腺病毒感染細(xì)胞最佳MOI值測(cè)定

復(fù)蘇的秦川牛前體脂肪細(xì)胞經(jīng)1周的傳代培養(yǎng)后所得到的第3代細(xì)胞的形態(tài)大多數(shù)呈短梭形或多角形，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形。將其接種于24 孔培養(yǎng)板中，并分別感染不同劑量的腺病毒。經(jīng)48 h后觀察發(fā)現(xiàn)，AD-bSMAD3、AD-NC、AD-ShRNA-bSMAD3、AD-ShRNA-NC的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)分別為100、25、100、50時(shí)效果最好(圖5A～5D)，此時(shí)細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的病變效應(yīng)且綠色熒光表達(dá)量較多，所以確定此濃度為最佳感染濃度。

2.5 秦川牛前體脂肪細(xì)胞Smad3基因的過(guò)表達(dá)效率和干擾效率檢測(cè)

高滴度過(guò)表達(dá)和干擾腺病毒侵染牛前體脂肪細(xì)胞3、6、9天時(shí)，熒光顯微鏡下都可以觀察到有95%以上的細(xì)胞能成功表達(dá)綠色熒光蛋白。分別提取RNA，通過(guò)qRT-PCR試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，Smad3基因表達(dá)量分別上調(diào)了1 031倍、1 286倍、633倍(圖6A)和分別下調(diào)了70%、55%、57%(圖6B)。這些結(jié)果表明，Smad3腺病毒過(guò)表達(dá)和干擾載體構(gòu)建成功，為開(kāi)展Smad3基因調(diào)控牛前體脂肪細(xì)胞的功能鑒定奠定了基礎(chǔ)。

A.病毒重組子轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞24 h綠色熒光情況觀察；B. 轉(zhuǎn)染9 d綠色熒光形成彗星狀的熒光聚集現(xiàn)象；C.轉(zhuǎn)染12 d綠色熒光變亮并鋪滿整個(gè)視野，大量細(xì)胞變圓脫壁，形成空斑；D.高滴度病毒侵染HEK293A細(xì)胞24 h綠色熒光分布情況；E.病毒原液分別稀釋102、103、104、105、106、107、108、109倍A. Fluorescence microscopic image of HEK293A cells transfected after 24 h; B. Fluorescence microscopic image after 9 d adenovirus transfection; C. CPE after 12 d adenovirus transfection; D. Fluorescence microscopic image after high titer adenovirus transfection for 24 h; E. The virus was diluted 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 and 109 times圖4 干擾重組腺病毒的包裝及病毒滴度測(cè)定Fig.4 Interference recombinant adenovirus packaging and their titer determining

A. MOI值為100時(shí)感染AD-bSMAD3的牛前體脂肪細(xì)胞; B. MOI值為25時(shí)感染AD-NC的牛前體脂肪細(xì)胞; C. MOI值為100時(shí)感染AD-ShRNA-bSMAD3的牛前體脂肪細(xì)胞; D. MOI值為50時(shí)感染AD-ShRNA-NC的牛前體脂肪細(xì)胞A. MOI value is 100, Qinchuan cattle preadipocytes infected by AD-bSMAD3; B. MOI value is 25, Qinchuan cattle preadipocytes infected by AD-NC; C. MOI value is 100, Qinchuan cattle preadipocytes infected by AD-ShRNA-bSMAD3; D. MOI value is 50, Qinchuan cattle preadipocytes infected by AD-ShRNA-NC圖5 Smad3基因重組腺病毒侵染秦川牛前體脂肪細(xì)胞最佳MOI值測(cè)定Fig.5 Qinchuan cattle preadipocytes infected by Smad3 recombinant adenovirus with the optimal MOI value

2.6 Smad3基因抑制秦川牛前體脂肪細(xì)胞分化

腺病毒侵染牛前體脂肪細(xì)胞后，收集成脂誘導(dǎo)分化第6天的細(xì)胞，進(jìn)行油紅O染色。對(duì)脂質(zhì)聚集觀察發(fā)現(xiàn)，AD-bSMAD3處理組明顯的減少了脂滴積累，而AD-ShRNA-bSMAD3處理組的脂滴積累則明顯增加(圖7A)。同時(shí)，qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與AD-NC組相比，AD-bSMAD3處理組的成脂標(biāo)志基

因PPARγ、FABP4、C/EBPα和C/EBPβ的 mRNA水平均顯著地下調(diào),相反地，與AD-ShRNA-NC組相比，AD-ShRNA-bSMAD3處理組的成脂標(biāo)志基因PPARγ、FABP4、C/EBPα和C/EBPβ的mRNA水平均顯著地上調(diào)(圖7B)。結(jié)果表明，Smad3基因能夠顯著的抑制秦川牛前體脂肪細(xì)胞的分化。

A. Smad3基因過(guò)表達(dá)效率檢測(cè)；B. Smad3基因干擾效率檢測(cè)。不同處理間，**表示P<0.01, ***表示P<0.001，下圖同A. The overexpression efficiency Smad3 gene; B. The interference efficiency of Smad3 gene. Between different treatments: **. P < 0.01, ***. P<0.001, the same as the following figure圖6 Smad3基因過(guò)表達(dá)效率和干擾效率檢測(cè)Fig.6 Detection of overexpression and interference efficiency of Smad3 gene

A.秦川牛前體脂肪細(xì)胞在侵染AD-bSMAD3、AD-NC、AD-ShRNA-bSMAD3、AD-ShRNA-NC后，誘導(dǎo)分化6天，油紅O染色圖；B. 成脂標(biāo)記基因PPARγ、FABP4、C/EBPα和C/EBPβ的表達(dá)檢測(cè)A. Oil Red O staining for day 6 Qinchuan cattle preadipocyte infected by AD-bSMAD3, AD-NC, AD-ShRNA-bSMAD3, AD-ShRNA-NC； B. Detection of PPARγ, FABP4, C/EBPα and C/EBPβ expression圖7 腺病毒介導(dǎo)Smad3基因調(diào)控秦川牛前體脂肪細(xì)胞分化Fig.7 Smad3 gene regulating the Qinchuan cattle preadipocyte differentiation mediated by adenovirus

3 討 論

肌內(nèi)脂肪的分布和含量決定了大理石花紋豐度，而大理石花紋的豐度是衡量牛肉品質(zhì)的重要指標(biāo)。動(dòng)物體內(nèi)，脂肪組織的沉積以及脂質(zhì)的合成主要是由脂肪細(xì)胞數(shù)量增多以及體積的不斷增大決定的[14]。目前已經(jīng)證實(shí)，TGF-β超家族成員在脂肪細(xì)胞分化和誘導(dǎo)中對(duì)脂滴合成與沉積起到關(guān)鍵的調(diào)控作用[15-16]。而在TGF-β信號(hào)通路中，Smad3蛋白起到至關(guān)重要的作用，它們能將信號(hào)由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)至細(xì)胞核中從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，是TGF-β家族的直接作用底物[17-18]。秦川牛的Smad3基因定位于10號(hào)染色體上，CDS區(qū)全長(zhǎng)1 278 bp，編碼了425個(gè)氨基酸。本試驗(yàn)利用秦川牛脂肪組織反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板在高保真酶的作用下成功克隆得到秦川牛Smad3基因序列。由于腺病毒載體產(chǎn)生的病毒顆粒比較穩(wěn)定，能有效地將外源基因轉(zhuǎn)染到各種靶細(xì)胞或組織中，病毒的包裝容易，且滴度易于提高，并且不會(huì)對(duì)人的身體健康產(chǎn)生影響，這使得腺病毒成為細(xì)胞試驗(yàn)中最常用的病毒載體之一，成為表達(dá)和傳遞治療基因的主要候選者[19-20]。為了更好地研究Smad3基因在秦川牛脂肪的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到的調(diào)控作用，選擇利用腺病毒的侵染性以實(shí)現(xiàn)目的基因Smad3在真核細(xì)胞的過(guò)表達(dá)和干擾。本試驗(yàn)采用Ad5腺病毒改造的AdMaxTM重組腺病毒包裝系統(tǒng)，與前期使用的腺病毒載體系統(tǒng)ViraPowerTMAdenoviral Expression System及AdEasyTMAdenoviral Vector System不同，只需要連接穿梭載體然后在重組酶的作用下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)重組，而且包裝過(guò)程需要不斷傳代，但是獲得的腺病毒滴度和侵染效率均較高[21-23]。相同點(diǎn)是，與脂質(zhì)體等介導(dǎo)的化學(xué)試劑轉(zhuǎn)染法，應(yīng)用電轉(zhuǎn)移、核轉(zhuǎn)移等物理方法比較，這幾種腺病毒載體都能最大限度的保護(hù)細(xì)胞不受損傷，還能使細(xì)胞保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)[24-25]。本研究最后選擇了試驗(yàn)中所得到的4代過(guò)表達(dá)腺病毒，其滴度可以達(dá)到1×1010pfu·mL-1。按MOI值侵染秦川牛前體脂肪細(xì)胞3、6、9 d后，與Ad-NC對(duì)照組相比，牛成肌細(xì)胞中Smad3基因的表達(dá)量顯著上調(diào)了1 031、1 286、633倍(P<0.001)。同樣用所得到的4代腺病毒干擾病毒AD-ShRNA-bSMAD3，與AD-ShRNA-NC對(duì)照組相比，Smad3基因的表達(dá)量分別下調(diào)了70%，55%，57%(P<0.01)。說(shuō)明腺病毒AD-bSMAD3和AD-ShRNA-bSMAD3具有很好的過(guò)表達(dá)和干擾效果，為下一步研究Smad3基因在成脂分化過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

脂肪的生長(zhǎng)發(fā)育是依賴于多種信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子相互作用的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。有一些促進(jìn)脂肪生成的因素，如在成脂發(fā)生的早期階段，C/EBPβ(CCAAT enhancer binding proteinsβ)顯著上調(diào)，然后激活了C/EBPα(CCAAT enhancer binding proteinsα)和PPARγ表達(dá)；C/EBPα和PPARγ互相調(diào)控進(jìn)一步激活了下游成脂基因FABP4(fatty acid binding protein 4)和FASN(fatty acid synthase)的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)了成熟脂肪的形成[26-28]。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β超家族配體在前體脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化過(guò)程中起著十分重要的作用，但其在脂肪形成過(guò)程中的詳細(xì)功能至今也不是很清楚。研究表明，TGF-β在肥胖的模式動(dòng)物和人體內(nèi)高表達(dá)，在脂肪細(xì)胞中脂肪的形成過(guò)程中會(huì)被Smad3抑制[12-13]。而在Smad3缺失的小鼠體內(nèi)，飲食誘導(dǎo)的肥胖會(huì)被抵制,并且這些小鼠的脂肪形成能力會(huì)顯著降低[29-30]。也就是說(shuō)TGF-β信號(hào)通路對(duì)脂肪的調(diào)控在體內(nèi)和體外的研究結(jié)果是相互矛盾的，其具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。有研究表明，TGF-β信號(hào)通路抑制脂肪的生成有一部分依賴于Smad3信號(hào)通路。Smad3被TGF-β激活后，與C/EBPβ和C/EBPδ(CCAAT enhancer binding proteinsδ)結(jié)合，抑制他們的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，這反過(guò)來(lái)導(dǎo)致了PPARγ轉(zhuǎn)錄的減少，是脂肪生成的主要調(diào)節(jié)劑，從而抑制了脂肪生成的過(guò)程[31]。然而，也有報(bào)道證明，TGF-β信號(hào)通路抑制脂肪的生成也可以不依賴于Smad3基因[32]。為了進(jìn)一步研究Smad3基因的調(diào)控機(jī)制，本試驗(yàn)利用前期獲得的高滴度腺病毒侵染秦川牛前體脂肪細(xì)胞，由油紅O染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Smad3基因后能夠抑制細(xì)胞中脂滴的沉積，相反地，干擾Smad3基因后，能夠促進(jìn)細(xì)胞中脂滴的形成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，Smad3基因顯著的下調(diào)了成脂基因C/EBPβ、C/EBPα、PPARγ和FABP4的表達(dá)。這些結(jié)果初步證明，Smad3可能參與了脂肪生成的早期調(diào)控，是調(diào)控秦川牛前體脂肪細(xì)胞分化的一個(gè)負(fù)向調(diào)控因子。而Smad3基因?qū)/EBPβ、C/EBPα、PPARγ和FABP4基因是直接調(diào)控作用還是間接調(diào)控作用需要進(jìn)一步探討研究。

4 結(jié) 論

本研究成功獲得了秦川牛Smad3基因的過(guò)表達(dá)和干擾重組腺病毒。研究表明，Smad3基因抑制秦川牛前體脂肪細(xì)胞分化及成脂關(guān)鍵基因的表達(dá)，這為進(jìn)一步探索TGF-β信號(hào)通路調(diào)控脂肪形成的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。