王 雙，楊海峰，余 波，李士洋，鄭育基，卜仕金*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州225009；2. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州225300；3.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人畜共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州225009)

烯丙孕素是一種應(yīng)用廣泛的甾類孕激素，有明顯的孕激素和抗促性腺激素作用，可抑制排卵。在國(guó)外獸醫(yī)臨床實(shí)踐中，烯丙孕素主要用于母豬[1]、母馬[2]的同期發(fā)情；而在國(guó)內(nèi)獸醫(yī)臨床實(shí)踐中，烯丙孕素主要用于促進(jìn)母豬同期發(fā)情，還可用于促進(jìn)乏情母豬的發(fā)情、延遲后備母豬的發(fā)情、延遲母豬的分娩時(shí)間[3]。但有關(guān)動(dòng)物試驗(yàn)表明，烯丙孕素可導(dǎo)致死胎率增加、產(chǎn)仔數(shù)下降、卵巢畸形[4]。若人類長(zhǎng)期食用含有此激素的食品，不僅會(huì)干擾人體正常的激素平衡，還會(huì)有明顯的致癌效應(yīng)，可導(dǎo)致女性及其后代生殖器官畸形和癌變，對(duì)于兒童則更明顯。歐美等國(guó)家已對(duì)該藥的使用和最高殘留限量(MRL)作了嚴(yán)格規(guī)定(皮下脂肪為4 μg·kg-1，肝為2 μg·kg-1)，國(guó)內(nèi)尚未見有關(guān)規(guī)定。食品安全問題越來越受我國(guó)人民的重視，鑒于人們經(jīng)常食用豬肉、豬腎、豬肝，本研究開展了烯丙孕素在豬肌肉、腎、肝、脂肪中的殘留檢測(cè)。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于烯丙孕素的殘留檢測(cè)方法主要是液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，文獻(xiàn)報(bào)道了在河豚魚、鰻魚[5]、豬肉[6]中烯丙孕素的檢測(cè)，但是這些研究都是通過結(jié)合固相萃取小柱來完成的，前處理復(fù)雜，用時(shí)較長(zhǎng)，不適合快速檢測(cè)，且運(yùn)行成本較高。本研究對(duì)寧波第二激素廠自主研制的烯丙孕素口服液開展烯丙孕素在豬肌肉、腎、肝、脂肪中的殘留檢測(cè)，采用乙腈提取，飽和正己烷脫脂，10%碳酸鈉溶液凈化，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定了豬可食性組織(肉、脂肪、肝、腎)中的烯丙孕素殘留，探索其在豬體內(nèi)的殘留規(guī)律，以期能填補(bǔ)國(guó)內(nèi)對(duì)該激素的殘留消除規(guī)律的研究空缺，并為新獸藥在我國(guó)臨床上的合理應(yīng)用和休藥期制訂提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

ACQUITY TM超高效液相色譜儀：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；Q-trap 5500 三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)AB公司產(chǎn)品；Eppendorf 5810R Centrifuge 高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；BS124S分析天平：德國(guó)賽多利斯天平公司產(chǎn)品；Pacific RO純水儀：北京五洲東方科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；SI可調(diào)速漩渦混合器 VORTEX-GENIE2：上海思伯明儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；氮吹儀：美國(guó)Organomation公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品、主要試劑與配制

烯丙孕素(altrenogest)標(biāo)準(zhǔn)品(純度為99.2%)：寧波第二激素廠產(chǎn)品。乙腈、甲酸銨：色譜純，美國(guó)Tedia公司產(chǎn)品；碳酸鈉、乙酸鈉、正已烷、乙酸乙酯：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶：德國(guó)默克公司；乙酸：HPLC級(jí)，美國(guó)Tedia公司產(chǎn)品。

烯丙孕素口服液：含量規(guī)格為1 mL:4 mg，包裝規(guī)格為450 mL·瓶-1，批號(hào)：160415；寧波第二激素廠產(chǎn)品。

烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：準(zhǔn)確稱取10 mg烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，即配成烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 000 μg·mL-1)。準(zhǔn)確吸取1 mL儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相(5 mmol·L-1甲酸銨溶液∶乙腈=6∶4)定容到1 L，即得1 μg·mL-1烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)工作液。

5 mmol·L-1甲酸銨溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.315 g甲酸銨至1 000 mL容量瓶中，用超純水溶解并定容，即配成5 mmol·L-1甲酸銨溶液。0.45 μm無機(jī)濾膜負(fù)壓過濾,超聲波振蕩20 min?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

0.2 mol·L-1乙酸鈉緩沖溶液：稱取16.4 g乙酸鈉溶解于800 mL水中，用乙酸調(diào)節(jié)pH至5.2，用水定容至1 L。

乙腈飽和正已烷：取500 mL正已烷，加入適量乙腈，充分振搖后，待兩相分層，上層即為乙腈飽和正已烷溶液。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

選取22頭達(dá)到性成熟的商品后備母豬(平均體重為50 kg)，隨機(jī)分為兩組，分別為烯丙孕素推薦劑量組(簡(jiǎn)稱試驗(yàn)組，20頭)、空白對(duì)照組(簡(jiǎn)稱對(duì)照組，2頭)。試驗(yàn)豬均圈養(yǎng)，給藥前分別稱重、編號(hào)。試驗(yàn)前試驗(yàn)豬在新環(huán)境經(jīng)過至少1周的適應(yīng)期。給藥前禁食過夜12 h，2 h后恢復(fù)正常飲食。飼料為不含任何藥物的全價(jià)飼料。

1.4 給藥劑量、途徑及樣品采集

試驗(yàn)組豬按0.4 mg·kg-1內(nèi)服給藥(相當(dāng)于每頭豬20 mg烯丙孕素)，每天定時(shí)給藥一次，連用18 d。給藥時(shí)烯丙孕素口服液按推薦劑量灑在受試動(dòng)物的飼料表層，讓動(dòng)物經(jīng)口自由攝入。于停藥后6 h、1 d、5 d、10 d和18 d共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別屠宰各試驗(yàn)組豬4頭，分別取肌肉(背最長(zhǎng)肌)、全肝、全腎、脂肪(皮下脂肪)。樣本采集后立即做好標(biāo)記、包裝，于-20 ℃冰箱中保存待測(cè)。

1.5 色譜-質(zhì)譜條件

1.5.1 色譜條件 色譜柱：Thermo C18(3×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：A為5 mmol·L-1甲酸銨溶液，B為乙腈，梯度洗脫條件見表1；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1梯度洗脫條件

Table1Gradientelutionconditions

時(shí)間/mint流速/(mL·min-1)Flow rate流動(dòng)相比例/%Mobile phase proportionA(甲酸銨)B(乙腈)00.4604010.4604040.4109080.410908.10.46040100.46040

1.5.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；電噴霧電壓：5.5 kV；去簇電壓：126.8 U·V-1；離子化溫度：550 ℃；氣簾氣：20.0 Psi；碰撞氣：8 Psi。定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、保留時(shí)間、錐孔電壓和碰撞能量參考值見表2。

表2烯丙孕素質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

Table2Altrenogestandtestosteronemassspectrometry

化合物Chemical compound定性離子對(duì)(m/z)Qualitative ion pair定量離子對(duì)(m/z)Quantitative ion pair錐孔電壓/VCone voltage碰撞能量/eVCollision energy烯丙孕素311.1>269.2311.1>227.1*2822,18

*.定量離子對(duì)

*. Represents the quantitative ion pair

1.6 樣品前處理

1.6.1 提取肝、腎樣品 ①稱取試樣2 g(精確至0.01 g)，置于50 mL離心管中，加入5 mL乙酸鈉溶液，再加入20 μL β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，然后蓋蓋渦旋混合1 min，在37 ℃±1 ℃振蕩酶解12 h ，取出冷卻至室溫，加入2 g氯化鈉，振搖30 s后加入8 mL 乙腈，渦旋提取1 min，5 000 r·min-1離心5 min，取乙腈層。②試樣中再加入8 mL乙腈，重復(fù)上述提取過程。合并2次提取液，加入8 mL乙腈飽和正已烷，渦旋提取1 min，5 000 r·min-1下離心2 min，棄去正已烷后取乙腈層 40 ℃下氮吹至近干。

1.6.2 肌肉、脂肪樣品 稱取試樣2 g(精確至0.01 g)，置于50 mL離心管中，加入8 mL乙腈，振蕩提取30 min，5 000 r·min-1離心5 min，取乙腈層。此后同“1.6.1”步驟②操作。

1.6.3 凈化 將以上所得殘?jiān)?0 mL乙酸乙酯復(fù)溶，渦旋30 s，然后加入10%碳酸鈉溶液2 mL，渦旋混合30 s后5 000 r·min-1離心5 min，取上清液40 ℃水浴中氮?dú)獯抵两珊笥脴悠范ㄈ萑芤?5 mmol·L-1甲酸銨水溶液∶乙腈=6∶4)1.0 mL 溶解，旋渦混勻后過0.22 μm濾膜。濾液供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.7 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取適量烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)溶液，先用流動(dòng)相配制質(zhì)量濃度為1、5、10、50、100、200 ng·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后加1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液到經(jīng)提取凈化吹干后的不同空白基質(zhì)殘?jiān)?，旋渦混勻后過0.22 μm 濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，以定量離子對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制基質(zhì)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 檢測(cè)限、定量限的測(cè)定

取空白的豬肝、皮下脂肪、肌肉、腎樣品，按照“1.6”所述方法處理，均設(shè)20個(gè)平行樣品，測(cè)得基線噪音值，取信噪比S/N≥3確定為檢測(cè)限，S/N≥10確定為定量限，并計(jì)算LOQ質(zhì)量濃度點(diǎn)的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，驗(yàn)證其可靠性。

1.9 回收率、精密度的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取空白試驗(yàn)樣品(豬肝、皮下脂肪、肌肉、腎)2.00 g±0.05 g，準(zhǔn)確加入適量標(biāo)準(zhǔn)工作液，使樣品中藥物的添加濃度為1、100和200 μg·kg-1。同時(shí)進(jìn)行空白樣品處理。每個(gè)濃度分別設(shè)6個(gè)平行。添加樣品經(jīng)“1.6”所述方法提取凈化后進(jìn)行LC-MS/MS測(cè)定；空白樣品經(jīng)同樣步驟處理后按照“1.6.3”方法制備與2、200和400 μg·L-1基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后進(jìn)行LC-MS/MS測(cè)定，根據(jù)添加樣品中烯丙孕素定量離子對(duì)峰面積和相應(yīng)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(1、100和200 μg·kg-1添加濃度分別選擇2、200和400 μg·L-1基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行單點(diǎn)定量)中定量離子對(duì)峰面積的比值計(jì)算回收率。每種樣品在一周內(nèi)完成3個(gè)批次重復(fù)測(cè)定。據(jù)此求出各批內(nèi)與批間變異系數(shù)。

1.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)濃度水平為1、100、200 μg·L-1的5個(gè)平行穩(wěn)定性樣品執(zhí)行分析，從而評(píng)估烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)工作液中烯丙孕素的穩(wěn)定性。采用流動(dòng)相稀釋的方法分別制備上述3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液后立刻對(duì)樣品執(zhí)行分析，以得到第0天數(shù)據(jù)；在室溫(約22 ℃)下放置2、6、8 h后執(zhí)行樣品分析。將標(biāo)準(zhǔn)工作液中檢出的烯丙孕素濃度與理論加標(biāo)濃度做比較(烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)工作液現(xiàn)配現(xiàn)用)。

將5 ng·mL-1烯丙孕素溶液(甲醇溶解)放置在太陽光下，室溫25 ℃，分別于45 min、2 h、4 h、6 h 后測(cè)定烯丙孕素濃度，檢驗(yàn)其光照穩(wěn)定性。

1.11 豬組織中烯丙孕素殘留量的測(cè)定

檢測(cè)“1.4”采集的背最長(zhǎng)肌肉、皮下脂肪、肝、腎組織樣品中烯丙孕素的濃度。

2 結(jié) 果

2.1 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線

以烯丙孕素定量離子對(duì)的色譜峰面積(A)對(duì)烯丙孕素的質(zhì)量濃度(C，μg·kg-1)作圖，得到其基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。烯丙孕素在1～200 ng·mL-1的濃度范圍內(nèi)，該藥物的定量離子峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系，線性回歸方程：y=5.34e4X+6.87e4，相關(guān)系數(shù)0.999。

2.2 檢測(cè)限和定量限

向空白組織中添加一系列低濃度的烯丙孕素溶液，以信燥比(S/N)為3計(jì)算檢測(cè)限(LOD)，以信燥比為10計(jì)算定量限(LOQ)。結(jié)果顯示：該藥物的檢測(cè)限為0.5 μg·kg-1，定量限為1.0 μg·kg-1。

2.3 回收率和精密度

烯丙孕素在豬肌肉、皮下脂肪、肝、腎中回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差測(cè)定結(jié)果見表3。

由表3可知，本方法的平均添加回收率在68.9%～78.9%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.92%～10.49%和4.92%～9.95%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于11%。由此可見，在低濃度樣品加標(biāo)下，LC-MS/MS法測(cè)定豬組織中烯丙孕素殘留具有良好的回收率和精密度，該方法適用于復(fù)雜基質(zhì)中痕量化合物的定量和定性分析。

2.4 烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)工作液穩(wěn)定性

對(duì)于烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)工作液中的烯丙孕素而言，于室溫條件(約22 ℃)下儲(chǔ)存時(shí)可保持穩(wěn)定達(dá)6 h。

2.5 光照穩(wěn)定性

結(jié)果顯示，6 h時(shí)烯丙孕素降解了35%。烯丙孕素和它的初級(jí)光解產(chǎn)物在Thermo C18反相色譜柱上的出峰時(shí)間分別為4.54、4.99 min，見圖1、圖2。在不嚴(yán)格避光的條件下，烯丙孕素在豬組織中部分會(huì)光解為其同分異構(gòu)體，色譜圖中會(huì)有兩個(gè)藥物峰出現(xiàn)，計(jì)算含量時(shí)要對(duì)兩個(gè)峰同時(shí)定量，面積和即為烯丙孕素的真實(shí)含量。

2.6 豬組織中烯丙孕素殘留量的測(cè)定

以0.4 mg·kg-1(按體重給藥)劑量?jī)?nèi)服給藥18 d后，對(duì)背最長(zhǎng)肌肉、皮下脂肪、肝、腎樣品中烯丙孕素濃度進(jìn)行測(cè)定，對(duì)照組均未檢出烯丙孕素殘留，給藥組背最長(zhǎng)肌肉、皮下脂肪、肝、腎中烯丙孕素濃度隨時(shí)間變化見圖3，各個(gè)組織中殘留量測(cè)定結(jié)果見表4。

烯丙孕素溶液按推薦給藥方案給藥，停藥后6 h各組織均達(dá)到最高藥物濃度，其中肝殘留最高，平均殘留量為259.25 μg·kg-1，其次依次是腎、皮下脂肪、肌肉，平均殘留量分別為52.33、49.22、25.85 μg·kg-1； 停藥至第1天后，肝、腎、皮下脂肪和肌肉中烯丙孕素的平均殘留量分別降至33.93、11.27、41.95和9.56 μg·kg-1。至停藥第5天時(shí)，4頭豬中僅1頭豬的肝中烯丙孕素的殘留量高于MRLs(2 μg·kg-1)，達(dá)到2.81 μg·kg-1；另3頭豬中，來自1頭豬的肝中烯丙孕素的殘留量高于定量限(1.0 μg·kg-1)，其他組織中烯丙孕素的殘留量均低于定量限；至停藥第10天時(shí)，豬所有組織中烯丙孕素的殘留量都低于檢測(cè)限。

表3烯丙孕素加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

Table 3 The recoveries and RSD of altrenogest(n=6) %

圖1 對(duì)照溶液中烯丙孕素特征離子質(zhì)量色譜圖(5 μg·kg-1)Fig.1 Standard sample of altrenogest(5 μg·kg-1)

2.7 烯丙孕素在豬體內(nèi)的休藥期

依據(jù)EMA發(fā)布的烯丙孕素在豬的肝組織中的殘留限量，將停藥后烯丙孕素在豬的肝組織中實(shí)測(cè)的殘留量數(shù)據(jù)采用WT1.4休藥期軟件擬合，如按雙單側(cè)95%置信區(qū)間計(jì)算休藥期為7.59 d，如按雙單側(cè)99%置信區(qū)間計(jì)算則休藥期為8.67 d，如圖4、5所示。因此寧波第二激素廠提供的烯丙孕素溶液按推薦給藥方案使用，建議休藥期定為9 d。

圖2 光照2 h后對(duì)照溶液中烯丙孕素特征離子質(zhì)量色譜圖(5 μg·kg-1)Fig.2 Standard sample of altrenogest after the sun shined for two hours(5 μg·kg-1)

圖3 豬組織中烯丙孕素殘留消除曲線Fig.3 Residues eliminate curve of altrenogest in swine tissues

3 討 論

3.1 烯丙孕素的光照穩(wěn)定性

烯丙孕素結(jié)構(gòu)中有1,2環(huán)戊烷并多氫菲基本母核，甾核由A、B、C和D環(huán)稠合而成，A、B、C為六元環(huán)，D為五元環(huán)，D環(huán)C-17有烯丙基側(cè)鏈，環(huán)中有雙鍵，這使得它在紫外-可見光照射下吸收一定波長(zhǎng)的光，從而發(fā)生直接光解。Wammer等[7]報(bào)道，在太陽輻射能為250 w·m-2，室溫30 ℃，pH=6的條件下，10 μmol·L-1烯丙孕素溶液(10%甲醇水溶解)迅速降解為1.6 nmol·L-1，光解半衰期為27 s(kobs=2.58±0.04×10-2)；光解速率隨著烯丙孕素濃度的升高而升高，隨氧氣濃度的升高而降低，不隨pH和溫度的變化而變化。此外，光解速率還與烯丙孕素溶液的組成有關(guān)，有機(jī)物濃度越高光解速率越慢，在上述相同條件下，40和80 mg·L-1腐殖酸中烯丙孕素光解半衰期分別為6和10 min。為避免失去藥理學(xué)活性，烯丙孕素溶液應(yīng)避光保存。

表4給藥后豬可食性組織中烯丙孕素殘留量

Table 4 Residues of altrenogest in swine tissuesμg·kg-1

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度是十倍稀釋后測(cè)定的

The concentration beyond the standard curve was measured after ten times dilution

圖4 按雙單側(cè)95%置信區(qū)間擬合的休藥期擬合曲線Fig.4 Plot of withdrawal time calculation for swine liver at the time when the one-sided 95% upper tolerance limit was below the EU MRL

圖5 按雙單側(cè)99%置信區(qū)間擬合的休藥期擬合曲線Fig.5 Plot of withdrawal time calculation for swine liver at the time when the one-sided 99% upper tolerance limit was below the EU MRL

烯丙孕素的初級(jí)光解產(chǎn)物是烯丙孕素通過環(huán)內(nèi)加成反應(yīng)得到的，它是烯丙孕素的同分異構(gòu)體[8]。烯丙孕素和它的初級(jí)光解產(chǎn)物性質(zhì)差異很大，據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，在C18反相色譜柱上，烯丙孕素和它的同分異構(gòu)體出峰時(shí)間分別為4.3、7 min。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，烯丙孕素和它的初級(jí)光解產(chǎn)物在Thermo C18反相色譜柱上的出峰時(shí)間分別為4.54、4.99 min，這與國(guó)外報(bào)道的結(jié)果一致。在不嚴(yán)格避光的條件下，烯丙孕素在豬組織中部分會(huì)光解為其同分異構(gòu)體，色譜圖中會(huì)有兩個(gè)藥物峰出現(xiàn)，計(jì)算含量時(shí)要對(duì)兩個(gè)峰同時(shí)定量，面積和即為烯丙孕素的真實(shí)含量。

3.2 酶解條件的優(yōu)化

有研究者用β-葡糖苷酸/芳基硫酸酯酶對(duì)動(dòng)物肌肉、內(nèi)臟等樣品進(jìn)行酶解，使藥物與組織解離，以提高藥物萃取效率[9]。但有學(xué)者認(rèn)為孕激素類藥物主要以游離態(tài)的形式存在，不需要酶解。EMEA[10]報(bào)道了給藥后30 d內(nèi)樣品(豬和馬肝、腎)中烯丙孕素/總殘留物。在豬和馬的肝樣品中，總殘留物的80%不可逆地結(jié)合在組織大分子上因而失去藥理學(xué)活性；其余殘留物在肝中游離并且具有藥理學(xué)活性，烯丙孕素/總殘留物最大(為25%)；在第15天，烯丙孕素/總殘留物最小(0.5%)。在豬和馬的腎樣品中，總殘留物的20%與組織大分子結(jié)合，總殘留物的80%游離出來并且具有藥理學(xué)活性。在肌肉和皮下脂肪樣品中因總殘留量太低無法計(jì)算出烯丙孕素/總殘留物，因此將肌肉和皮下脂肪組織中所有的殘留物都認(rèn)為是烯丙孕素。報(bào)道中顯示，烯丙孕素在肝、腎中代謝物主要是烯丙孕素的谷胱甘肽和葡萄糖苷酸結(jié)合物，故本試驗(yàn)用β-葡萄糖醛酸/芳基硫酸酯酶酶解的方法處理肝、腎樣品，直接提取處理肌肉、脂肪樣品。

3.3 動(dòng)物試驗(yàn)方案

本研究中的給藥周期、給藥劑量、給藥途徑是根據(jù)歐洲原研廠家提供的給藥方案(英特威烯丙孕素產(chǎn)品概要[11])和二期臨床試驗(yàn)結(jié)果制定的。給藥周期與母豬發(fā)情周期有關(guān)，我國(guó)母豬發(fā)情周期一般為18 d，為了實(shí)現(xiàn)同一批母豬同步發(fā)情，給藥周期必須與母豬發(fā)情周期保持一致；給藥劑量0.4 mg·kg-1為臨床推薦劑量，也與歐洲原研廠家提供的劑量相一致；EMEA與FDA批準(zhǔn)的給藥途徑為口服，經(jīng)口灌服操作繁瑣，容易引起動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)，不利于飼養(yǎng)員的操作，因此本研究采用將藥灑在飼料表面的方式給藥。實(shí)際給藥時(shí)一頭動(dòng)物與其他動(dòng)物的飼料槽是分開的，并且每次給藥后飼料基本上被吃光，這樣確保了烯丙孕素全部被利用。

3.4 提取條件的優(yōu)化

烯丙孕素屬于脂溶性化合物，烯丙孕素為弱極性化合物，難溶于水，易溶于乙醇、乙腈、丙酮、叔丁基甲醚等有機(jī)溶劑。常用于提取烯丙孕素的溶劑有叔丁基甲醚、甲醇[12]、乙腈[13]和乙酸乙酯。本試驗(yàn)比較了不同提取劑對(duì)回收率的影響，結(jié)果表明：用叔丁基甲醚提取時(shí)，烯丙孕素回收率高，為70%左右，但共提的脂肪較多，且藥物易與脂肪結(jié)合，影響提取效果；用乙酸乙酯提取時(shí)，烯丙孕素回收率63%，對(duì)烯丙孕素提取效果較差；甲醇乙腈提取效率較好，回收率都在80%左右，但是乙腈的除蛋白能力強(qiáng)于甲醇，而且用乙腈提取，共提雜質(zhì)較少，因此本研究選用乙腈作為前處理的提取試劑?？疾炝颂崛┑捏w積(分別采用8、10、15 mL乙腈進(jìn)行提取)和提取次數(shù)對(duì)提取效率的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，提取劑量為8 mL 提取兩次和提取劑量為15 mL提取兩次，兩者回收率相同，為了減少溶劑用量最終確定用8 mL乙腈提取兩次。

3.5 凈化條件的優(yōu)化

由于豬組織中含有大量的脂肪，因此有必要進(jìn)行脫脂。試驗(yàn)考察了8 mL乙腈飽和正己烷除脂與-20 ℃冷凍除脂這兩種方法的脫脂效果。結(jié)果表明：乙腈飽和正己烷能有效除去豬肌肉、皮下脂肪、肝、腎提取液中脂類和非極性雜質(zhì)的干擾，但會(huì)造成烯丙孕素在前處理過程中的損失，導(dǎo)致回收率偏低；冷凍除脂藥物回收率較高，但除脂量較少。乙腈飽和正己烷除脂之后，回收率達(dá)70%，可選用乙腈飽和正己烷作為除脂溶劑。

為了達(dá)到理想的凈化效果，脫脂后的溶液須進(jìn)一步凈化。試驗(yàn)比較了HLB、C18這2種甾類孕激素常用的柱子對(duì)提取液的凈化效果。研究發(fā)現(xiàn)，Oasis HLB是最符合本試驗(yàn)的SPE柱。將Oasis HLB 柱依次用3 mL甲醇、3 mL水活化平衡，將提取液氮吹復(fù)溶后過柱，用3 mL 20%乙腈水、3 mL水淋洗，真空抽10 s后，用3 mL乙腈洗脫，收集洗脫液于10 mL離心管中。由于固相萃取耗時(shí)，過程繁瑣，且費(fèi)用較高。據(jù)報(bào)道，萃取前用pH 9～10碳酸鹽溶液堿化樣品液可除去堿性雜質(zhì)，且凈化效果較好[14]。試驗(yàn)又繼續(xù)考察了10%、15%、20%碳酸鈉溶液的凈化效果，結(jié)果顯示，10%碳酸鈉溶液凈化效果較好，回收率較高。通過比較固相萃取和碳酸鈉溶液凈化的目標(biāo)藥物的峰面積發(fā)現(xiàn)差異不顯著，本研究采用10%碳酸鈉溶液凈化。

3.6 基質(zhì)效應(yīng)

利用ESI離子源對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分析時(shí)會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，試驗(yàn)中采用提取后添加法評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)。計(jì)算陰性基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液與流動(dòng)相標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)值的比值，當(dāng)比值接近1時(shí)說明不存在基質(zhì)效應(yīng)的影響；當(dāng)比值大于或小于1時(shí)，說明基質(zhì)對(duì)待測(cè)組分的響應(yīng)有增強(qiáng)或抑制效應(yīng)。本試驗(yàn)測(cè)定了質(zhì)量濃度為1、2、5 ng·mL-1的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液和流動(dòng)相標(biāo)準(zhǔn)溶液。結(jié)果顯示，肝、腎中兩個(gè)響應(yīng)值之比為0.50～0.54，肌肉、皮下脂肪中兩個(gè)響應(yīng)值之比為0.65～0.69，說明肝、腎中的基質(zhì)抑制效應(yīng)強(qiáng)于肌肉、皮下脂肪。為消除基質(zhì)效應(yīng)的干擾，本試驗(yàn)采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)液定量校正。

3.7 烯丙孕素在豬組織中的殘留消除規(guī)律及休藥期的確定

對(duì)肌肉、皮下脂肪、肝、腎中的烯丙孕素殘留量進(jìn)行分析比較，結(jié)果顯示，在同一采樣時(shí)間點(diǎn)，豬組織中烯丙孕素的殘留量規(guī)律為肝>腎>皮下脂肪>肌肉，這與EMEA[15]報(bào)道的國(guó)外同類產(chǎn)品在豬可食性組織中的殘留量檢測(cè)結(jié)果一致。藥物在肝中代謝，而且藥物在豬體內(nèi)主要經(jīng)膽汁、糞便、尿液排泄，在腎中不會(huì)造成蓄積，因此，在同一采樣時(shí)間點(diǎn)，烯丙孕素殘留量，肝>腎；脂肪中烯丙孕素殘留量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于肌肉中的殘留量，這是脂肪為親脂性化合物的緣故。由豬組織中烯丙孕素殘留消除曲線可以看出，除肝外其他組織在5 d后藥物濃度低于MRL，肝在10 d后藥物濃度低于MRL，表明烯丙孕素在豬體內(nèi)代謝較快，且在各組織無蓄積。肝中的藥物殘留量最高，消除時(shí)間最長(zhǎng)，故肝是烯丙孕素在豬可食性組織中的殘留靶組織。

根據(jù)烯丙孕素在豬組織中的殘留檢測(cè)值，采用WT1.4軟件按99%置信區(qū)間計(jì)算烯丙孕素在豬肝中的休藥期，結(jié)果顯示，休藥期為9 d，這一結(jié)果與歐洲原研廠家生產(chǎn)的烯丙孕素在豬體內(nèi)休藥期相同[11]，而美國(guó)等國(guó)家報(bào)道同類產(chǎn)品在豬體內(nèi)休藥期為21 d[16]， 這可能與不同產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝、豬的種類不同有關(guān)。參照歐盟和美國(guó)規(guī)定的烯丙孕素在豬組織中的最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)母豬按0.4 mg·kg-1(按體重給藥)內(nèi)服給藥18 d后其休藥期為9 d。

4 結(jié) 論

采用乙腈提取，乙腈飽和正己烷溶液除脂，10%碳酸鈉溶液凈化，建立高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬可食性組織(肉、脂肪、肝、腎)中的烯丙孕素殘留情況，該方法的檢測(cè)限為0.5 μg·kg-1，定量限為1.0 μg·kg-1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于11%。豬按0.4 mg·kg-1劑量經(jīng)口給藥，每天1次，連續(xù)給藥18 d。各組織烯丙孕素殘留量在休藥6 h后最高，休藥后第5天脂肪中的殘留量低于最大殘留限量，肌肉、腎中殘留量低于定量限，休藥第10天所有組織中烯丙孕素殘留量均低于定量限。組織殘留量由高到低依次為肝>腎>脂肪>肌肉，肝中烯丙孕素消除緩慢且消除時(shí)間最長(zhǎng)。建議此種給藥方式休藥期為9 d。