凌 南，范漻鈺，任建鸞，曾德新，薛 峰，戴建君

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095）

世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）定義的食源性人獸共患病是指通過食物在動(dòng)物與人之間傳播的感染和疾病。2016年世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)布的一份報(bào)告稱，每年至少有6億人，即全球1/10人口，因污染食物而患病，其中42萬人死亡，多為兒童、青少年；盡管5歲以下兒童僅占全球人口的9%，但他們卻占食源性疾病死亡人數(shù)的30%左右[1-2]。食源性細(xì)菌是食源性人獸共患病的主要病原，主要宿主是動(dòng)物，其引發(fā)的重大動(dòng)物傳染病嚴(yán)重影響了動(dòng)物源性食品安全與獸醫(yī)公共衛(wèi)生，因此如何快速檢測病原對保障畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康具有十分重要的意義。活細(xì)菌擁有毒力及致病性，可對機(jī)體造成傷害，所以檢測病原菌的關(guān)鍵是區(qū)分活死菌以及致病和非致病菌[3]。對活菌的判定指標(biāo)主要為：是否可培養(yǎng)，是否能新陳代謝從而形成產(chǎn)物，是否有完整的細(xì)胞膜。以下針對食源性人獸共患病的活菌檢測技術(shù)進(jìn)行概括，并選擇實(shí)用性較強(qiáng)的PMA-qPCR檢測方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1 活菌培養(yǎng)檢測技術(shù)

培養(yǎng)法是指在人為控制條件下，為特定微生物創(chuàng)造適宜的生長繁殖條件，從而達(dá)到特異性分離某種微生物的方法，被廣泛應(yīng)用于食品中的病原菌檢測，是目前使用最廣泛，也是最經(jīng)典的一種檢測手段?，F(xiàn)行食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中的細(xì)菌檢測大多采用培養(yǎng)法，如沙門氏菌（GB 4789.4）、單增李斯特氏桿菌（GB 4789.30）、溶血性鏈球菌（GB 4789.11）、副溶血性弧菌（GB 4789.7）等的檢測。培養(yǎng)法主要包括增菌、選擇性培養(yǎng)分離、生化鑒定等步驟，具有檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。培養(yǎng)法以得到活菌樣本為判定依據(jù)，具有極高的可信度，這也是其被廣泛應(yīng)用于食源性人獸共患病病原檢測的重要原因。

然而，培養(yǎng)法周期長，一般要4～5 d，有的甚者達(dá)到7 d ；而且過程繁瑣，對檢測人員要求較高，檢測結(jié)果受人為因素影響大，在挑選可疑菌落環(huán)節(jié)易造成檢測結(jié)果不一致，甚者造成假陰性。周期長、過程繁瑣的檢測技術(shù)已經(jīng)不適用于當(dāng)前的社會(huì)發(fā)展形勢，不僅阻滯了食品流通，也會(huì)影響食品品質(zhì)，從而造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。此外，培養(yǎng)法的檢測范圍有限，在低濃度水平下，對許多微生物的分離和鑒定都很困難[3]。某些細(xì)菌，如大腸桿菌、李斯特菌、綠膿桿菌等，可能會(huì)進(jìn)入到一個(gè)“活的但不可培養(yǎng)”（VBNC）狀態(tài)，這種情況下更無法進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。

2 活菌新陳代謝產(chǎn)物檢測技術(shù)

2.1 免疫學(xué)活菌檢測技術(shù)

免疫學(xué)活菌檢測技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)設(shè)計(jì)的活菌檢測方法。該方法是檢測機(jī)體產(chǎn)生的抗原、抗體、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子等。林賽君[4]利用酶聯(lián)免疫M(jìn)INI-VIDAS法，檢測單核增生李斯特菌的準(zhǔn)確度為99.6%，高于國標(biāo)法的99.2%。免疫學(xué)技術(shù)具有敏感性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)。但其假陽性率高，不能準(zhǔn)確進(jìn)行活菌定量檢測；單克隆抗體的制備較困難，容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，存在抗體與非抗原物質(zhì)之間的非特異性反應(yīng)；靈敏度較低，需要經(jīng)過必需的富集步驟。因此，在實(shí)際操作中，免疫學(xué)活菌檢測技術(shù)常常和其他技術(shù)聯(lián)合使用。

2.2 mRNA法

該方法利用逆轉(zhuǎn)錄酶對提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR，其原理是利用細(xì)菌轉(zhuǎn)錄物對胞內(nèi)和胞外RNase降解敏感。mRNA水平在細(xì)胞死亡后快速下降，所以mRNA只存在于活細(xì)胞內(nèi)，如大腸桿菌O157∶H7的RT-PCR測定[5]。但該方法存在一定缺陷：首先在逆轉(zhuǎn)錄PCR過程中，由于mRNA殘留的存在，會(huì)污染大量死亡細(xì)菌（104～107個(gè)/mL），從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果；其次細(xì)胞中的RNA豐度和穩(wěn)定性不均一，并且存在一些RNA分子，其在喪失活力后也可以在細(xì)胞中持續(xù)存在較長時(shí)間；最后RNA容易降解，處理RNA需要的技術(shù)含量偏高。因此，該方法不太符合快速、簡便檢測的要求，僅適合于科研領(lǐng)域。

2.3 ATP生物發(fā)光法

ATP是活細(xì)胞中含量相對穩(wěn)定的一種代謝物，其生物半衰期較短，當(dāng)細(xì)菌生長抑制或死亡后，菌體細(xì)胞內(nèi)的ATP含量會(huì)明顯下降或消失，因此ATP依賴性的熒火蟲發(fā)光素酶（Fire fl y luoiferase）催化熒火蟲發(fā)光素（Fire fl y luciferin）氧化發(fā)光反應(yīng)可作為活菌的檢測標(biāo)志。利用反應(yīng)發(fā)光強(qiáng)度和ATP呈正比的特性，可以得出樣品中的細(xì)菌數(shù)目。雖然該方法需要的試劑和實(shí)驗(yàn)器材簡單并且檢測快速，但靈敏度較低，測定極限為1×10-13mol，約1×104CFU活菌數(shù)[6]。同時(shí)，ATP 生物發(fā)光法不能區(qū)分微生物ATP與非微生物ATP，并且樣品本身、ATP提取劑等含有離子。這些離子又會(huì)對ATP的測定造成干擾，抑制發(fā)光。因此，生物發(fā)光法只局限于總細(xì)菌數(shù)量的檢測，不能用于區(qū)分致病菌與非致病菌，這在很大程度上限制了生物發(fā)光法的普及應(yīng)用。

2.4 指示劑法

細(xì)菌在代謝過程中產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物能夠還原一些指示劑并使之變色，因而可通過顏色變化來判定待檢樣品中的細(xì)菌活性。該方法常用的指示劑主要有 CTC、INT 和刃天青鹽。無菌時(shí)指示劑顏色為母液顏色，而當(dāng)有菌落時(shí)，指示液會(huì)被還原成紅色或者粉紅。Schaule等[7]將CTC偶聯(lián)熒光顯微鏡技術(shù)應(yīng)用于飲水和生物膜中活菌的檢測，證明該偶聯(lián)技術(shù)可對活菌進(jìn)行定量檢測。但是該方法使用的指示劑無法對細(xì)菌進(jìn)行特異性染色，而且CTC存在一定的毒性，從而影響細(xì)菌的生長代謝。

2.5 生物傳感器

生物傳感器是對生物物質(zhì)敏感并能將其濃度轉(zhuǎn)換為電信號的檢測儀器。Nanduri 等[8]應(yīng)用生物傳感器檢測單核細(xì)胞增生李斯菌，檢測限為2×106CFU/mL。生物傳感器具有穩(wěn)定性好、選擇性強(qiáng)、靈敏度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，能在復(fù)雜體系中進(jìn)行快速連續(xù)檢測。不同類型的生物傳感器具有各自獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，但又存在各自的局限性。生物傳感器本身不能鑒定菌種，常常需要和其他的檢測方法聯(lián)合使用，為此基于免疫原理的生物傳感器成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

2.6 噬菌體識別檢測技術(shù)

噬菌體是一種能夠侵入細(xì)菌并在宿主細(xì)菌體內(nèi)進(jìn)行增殖的病毒，具有拮抗細(xì)菌、裂解細(xì)菌的特性。噬菌體檢測技術(shù)的原理是利用噬菌體表達(dá)外源基因，將待選的基因片段定向插入噬菌體衣殼蛋白基因，通過親和富集法，篩選特異的蛋白質(zhì)或多肽的噬菌體，從而識別生物毒素、細(xì)菌、孢子和病毒的抗體等。基于噬菌體開發(fā)的檢測技術(shù)具有能區(qū)分活死菌的優(yōu)點(diǎn)。Favrin 等[9]將該免疫磁性分離噬菌體擴(kuò)增法用于肉湯中腸道沙門氏菌的檢測，發(fā)現(xiàn)檢出限達(dá)104CFU/mL。但由于噬菌體的一般宿主譜較窄，往往只對細(xì)菌某種血清型或分離株有特異性。

3 細(xì)胞膜完整性檢測技術(shù)

3.1 流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）是在流式細(xì)胞儀基礎(chǔ)上，對處于快速直線流動(dòng)狀態(tài)，且逐個(gè)通過光束的單個(gè)細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測手段。該技術(shù)能高速分析上萬個(gè)細(xì)胞，并能同時(shí)測量細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)。李影等[10]將流式細(xì)胞儀和熒光染色相聯(lián)合，對大腸桿菌的不可培養(yǎng)狀態(tài)進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)可培養(yǎng)菌數(shù)降為零時(shí)，與正常狀態(tài)細(xì)菌相比，誘導(dǎo)后菌株多數(shù)仍為呈現(xiàn)綠色熒光的活菌，活菌數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過死菌數(shù)，并且菌體形態(tài)多樣，每份樣品中至少存在兩種不同“顆粒”，結(jié)合熒光圖像可以確知桿狀、球狀或球桿狀菌體。由此表明，試驗(yàn)菌株在可培養(yǎng)數(shù)為零時(shí)就已進(jìn)入了VBNC狀態(tài)。流式細(xì)胞術(shù)和熒光染色的聯(lián)合運(yùn)用可客觀評價(jià)細(xì)菌的活性狀態(tài)，能較準(zhǔn)確分析出活死菌的數(shù)量或兩者數(shù)量的比例關(guān)系，但也存在一定缺陷。該方法雖能如實(shí)反映某一微生物區(qū)系中的細(xì)菌總數(shù)、存活狀態(tài)，以及活死細(xì)胞數(shù)量關(guān)系等，但卻無法鑒定和識別某一具體的微生物，尤其是處于VBNC狀態(tài)的細(xì)菌。此外，流式細(xì)胞儀分析樣品所需的熒光染料較多，劑量較大，價(jià)格昂貴，不適于大批量樣品檢測。

3.2 PMA/EMP-qPCR

該方法利用qPCR和生物染料PMA/EMA的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了檢測活死菌的目的。PMA/EMA與DNA結(jié)合的作用機(jī)制尚未完全闡明，可能是以下因素綜合作用的結(jié)果：（1）PMA/EMA不能通透細(xì)胞膜，只能選擇性地修飾死細(xì)胞“暴露”的DNA（細(xì)胞壁和細(xì)胞膜已破損的細(xì)胞）；（2）一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，染料插入核酸中，在暴露于強(qiáng)可見光下，染料上的疊氮基團(tuán)生成高反應(yīng)性的Nitrene基，很容易在結(jié)合部位與碳?xì)浠衔锝Y(jié)合生成穩(wěn)定牢固的共價(jià)氮碳鍵，從而形成穩(wěn)定的DNA修飾；（3）該修飾強(qiáng)烈抑制PCR中的連續(xù)DNA擴(kuò)增。因此，通過這種機(jī)制，EMA或PMA可以將死細(xì)胞優(yōu)選地嵌入DNA并防止死細(xì)胞隨后的DNA通過PCR擴(kuò)增（圖1）[11]，而當(dāng)PMA/EMA等核酸染料在強(qiáng)光作用下，同DNA偶聯(lián)結(jié)合，強(qiáng)光也會(huì)促使多余的核酸染料同水分子結(jié)合。剩余的羥胺（Hydroxylamine）不具有活性，因此完整細(xì)胞內(nèi)的DNA在提取過程中不會(huì)受到核酸染料影響。經(jīng)過核酸染料的鑒別，后續(xù)的PCR能特異性擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)有效鑒別活菌的目的。

圖1 利用PMA染料選擇性檢測活菌的原理（源自 https∶//biotium.com/product/pmatm-dye-20mm-in-h2o/）

PMA/EMA -PCR檢測已被用于檢測食源性人獸共患病病原[12-14]。Andreas等[15]利用EMA對細(xì)菌進(jìn)行預(yù)處理后，分別用微陣列技術(shù)和qPCR技術(shù)檢測活菌數(shù)，并對二者結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法都可以有效檢測出樣本中的活菌含量，結(jié)果高度一致。

4 PMA-qPCR活菌檢測技術(shù)驗(yàn)證

4.1 生物染料選擇

PMA為熒光染料PI的結(jié)構(gòu)類似物，用于活死菌檢測時(shí)與EMA的作用原理相似，但是二者穿透細(xì)胞的能力有較大區(qū)別。盡管EMA/PMA作用機(jī)制相同，但相對來說，EMA在信號抑制方面比PMA效果好，而PMA在判斷活死菌的準(zhǔn)確性上比EMA效果好。研究表明，EMA可穿透具有完整膜的細(xì)胞[16-17]。完整細(xì)胞攝取EMA的程度主要取決于細(xì)菌種類。這個(gè)問題對EMA的使用造成了嚴(yán)重限制。因此，對EMA的替代物PMA進(jìn)行了研究[16]。研究表明，與EMA相反，PMA被有效地從具有完整細(xì)胞膜的細(xì)胞排除，這可能是由于正電荷的增加。它適用于廣泛的革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌，因此選擇PMA作為生物染料，構(gòu)建PMA-qPCR檢測方法。

4.2 PMA-qPCR在副溶血性弧菌檢測中的應(yīng)用

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的研究基礎(chǔ)，建立針對副溶血弧菌PMA-qPCR活菌檢測技術(shù)，選擇toxR作為目的基因，設(shè)計(jì)引物及探針（表1）。

表1 以toxR為靶基因的PMA -qPCR探針引物

為了驗(yàn)證PMA的效果，設(shè)計(jì)了4組試驗(yàn)，分別是活菌（PMA）、活菌（W/O PMA）、死菌（PMA）、死菌（W/O PMA），細(xì)菌濃度為5×106CFU/mL，死菌用80 ℃處理。DNA用試劑盒（TIANamp Bacteria DNA Kit，DP302，TIANGEN）提取。W/O PMA組提取DNA后直接進(jìn)行qPCR，PMA組用PMA處理，終濃度為10 μg/mL，充分混勻后在黑暗中處理3 min，再將菌液放置BLU-V system（QIAGEN）中在60光照強(qiáng)度下處理2 min，使PMA和DNA充分結(jié)合，再進(jìn)行qPCR。可以看到濃度為5.0×106CFU/mL時(shí)，PMA能夠充分抑制死菌的擴(kuò)增，從而區(qū)分活菌和死菌（圖2）。

圖2 活菌和死菌的qPCR擴(kuò)增

試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，將PMA-qPCR結(jié)合，實(shí)現(xiàn)副溶血性弧菌活菌的快速檢測是可行的。在實(shí)際樣品檢測中可減少假陽率，所以將PMA應(yīng)用于副溶血性弧菌的快速檢測具有很好的應(yīng)用前景，針對不同食品基質(zhì)中副溶血性弧菌的檢測也有待于學(xué)者們的進(jìn)一步研究。近年來新型的LAMP環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與PMA結(jié)合降低了對試驗(yàn)器材的要求，雖然靈敏度略低于PMA-qPCR，但更簡單、經(jīng)濟(jì)，特別適合資源有限的機(jī)構(gòu)對病原體檢測的需要，商品化潛力更大。

5 小結(jié)

傳統(tǒng)培養(yǎng)法作為經(jīng)典方法仍是目前食源性人獸共患病病原檢測的主要手段，但因其檢測周期長，與食品的高效流通產(chǎn)生了矛盾。以檢測新陳代謝產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)的活菌檢測技術(shù)雖然具有檢測速度快的優(yōu)點(diǎn)，但卻存在假陽性率高、檢測靈敏度低、操作技術(shù)要求高等弊端，僅適用于小范圍或某些特殊菌體的高效快速檢測。

目前以細(xì)胞膜完整性檢測為標(biāo)準(zhǔn)的活菌檢測技術(shù)主要有流式細(xì)胞術(shù)和EMA/PMA-qPCR檢測技術(shù)。它們同樣具有檢測速度快的優(yōu)點(diǎn)。流式細(xì)胞術(shù)雖能快速區(qū)分活死菌，但其需要大型儀器且檢測費(fèi)用高，不具備區(qū)分菌種的功能，顯然也不適用于常規(guī)食品的病原菌檢測。PMA/EMA-qPCR檢測技術(shù)是建立在PCR技術(shù)基礎(chǔ)之上的，兼具檢測速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低等眾多優(yōu)點(diǎn)。PMA/EMA作為生物染料能巧妙排除死菌對PCR擴(kuò)增的干擾，從而實(shí)現(xiàn)通過PCR技術(shù)快速檢測活菌的目的。目前該技術(shù)已被眾多學(xué)者應(yīng)用于各種食源性人獸共患病病原活菌的快速檢測研究，其實(shí)際效果也得到了多數(shù)學(xué)者的肯定[12-16]。當(dāng)然，也有學(xué)者指出PMA/EMA存在缺陷：PMA/EMA處理時(shí)的強(qiáng)光照射會(huì)對菌體造成殺傷；當(dāng)PCR或qPCR的目的片段過短時(shí)，易造成PMA/EMA同目的片段結(jié)合疏漏，從而導(dǎo)致PMA/EMA對死菌DNA抑制不完全；菌液濃度過高或特殊的成團(tuán)菌體形態(tài)會(huì)影響PMA/EMA的穿透力，從而影響PMA處理效果[17-19]。但這些缺點(diǎn)并非不能解決，對于強(qiáng)光引起高溫殺傷，可以在PMA處理中用冰浴對菌液降溫；對于小目的片段的影響，可以設(shè)計(jì)特異性強(qiáng)的引物或設(shè)計(jì)巢式PCR；對于菌液濃度及特殊菌體形態(tài)的影響，可以通過稀釋及濾膜過濾分解成團(tuán)菌體。另外，對于濃度過低或復(fù)雜基質(zhì)的情況，可以通過磁珠富集優(yōu)化；對于部分革蘭氏陽性菌細(xì)胞膜成分復(fù)雜的情況，可以用月桂基巰基乙酸（Sodium lauroyl sarcosinate）來增加PMA對死菌細(xì)胞膜的通透性[20-23]。在眾多學(xué)者的研究基礎(chǔ)之上，本實(shí)驗(yàn)室以副溶血性弧菌活菌為檢測對象，對PMA-qPCR的活菌檢測效果進(jìn)行了驗(yàn)證，試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，PMA的處理可以有效抑制濃度高達(dá)5.0×106CFU/mL的死菌，卻不影響活菌檢出?？梢?，PMA-qPCR用于食源性人獸共患活菌的快速檢測是可行的，其作為一種新型的活菌快檢手段，具有廣闊的應(yīng)用前景。

此外，一種新型的鉑化合物也被證明可用于活菌檢測。鉑化合物主要用作有機(jī)化學(xué)中的催化劑，部分用作抗癌藥物，能有效穿透死菌，并與染色體DNA螯合。相比PMA/EMA，對可見光不太敏感的鉑化合物不需要光激發(fā)，而且價(jià)格低廉，可以代替EMA/PMA使用[16，18，24]，在比較苛刻的試驗(yàn)環(huán)境下，如在典型實(shí)驗(yàn)室（自然或者電燈實(shí)驗(yàn)環(huán)境下）可以直接添加鉑化合物進(jìn)行區(qū)分活死菌。然而，對該化合物的研究僅有少數(shù)報(bào)道，EMA/PMA-qPCR在食源性人獸共患病原菌活菌檢測技術(shù)中的廣泛應(yīng)用以及鉑化合物在該檢測體系中的應(yīng)用都有待于廣大學(xué)者進(jìn)一步研究。