木霉菌對(duì)土壤微生物多樣性及草莓生長(zhǎng)和發(fā)病的影響

王 寧，劉 銅，靳亞忠，咸洪泉

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島266109;2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江大慶163319)

木霉菌是優(yōu)良的生防真菌，在應(yīng)用真菌防治土傳病害的研究中，應(yīng)用最廣泛的真菌殺菌劑便是木霉菌［1］。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡是造成土傳病害發(fā)生的主要原因［2－3］，其多樣性高低是衡量土壤健康與否的一項(xiàng)重要指標(biāo)［4］。施用木霉菌后，通過對(duì)土壤微生物多樣性產(chǎn)生影響來達(dá)到防治病害、改良土壤的作用，因此，研究土壤微生物多樣性意義重大。目前微生物多樣性的研究方法多為活菌培養(yǎng)，局限在部分微生物總體數(shù)量研究，對(duì)種類的研究比較少，而土壤中的大多數(shù)微生物是無法進(jìn)行培養(yǎng)的，可培養(yǎng)率只有 0.1% ～1.0%［5－6］。高通量測(cè)序具有無需培養(yǎng)、能夠客觀還原菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)據(jù)量大等優(yōu)點(diǎn)［7］，近年來，高通量測(cè)序技術(shù)不斷發(fā)展，尤其是第二代測(cè)序方法，即Illumina 454和SOLiD Ion Torrent具有諸多優(yōu)點(diǎn)［8－10］。這些測(cè)序平臺(tái)最大數(shù)據(jù)產(chǎn)出通量高，在土壤微生物多樣性的研究中可以獲得豐富的信息［11－12］。因此，筆者試圖通過對(duì)土壤微生物基因組進(jìn)行高通量測(cè)序，研究木霉菌施用后對(duì)土壤微生物多樣性的影響，為進(jìn)一步揭示木霉菌和土壤微生物多樣性之間的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌劑為青島農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的木霉菌可濕性粉劑，棘孢木霉(Trichoderma asperellum)的孢子濃度為1×109CFU/g，草莓品種為紅顏。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)在黑龍江省大慶市薩爾圖區(qū)春雷農(nóng)場(chǎng)塑料大棚內(nèi)進(jìn)行，木霉菌可濕性粉劑于苗期施用。設(shè)木霉菌可濕性粉劑、對(duì)照2個(gè)處理，小區(qū)面積為0.02 hm2，共3次重復(fù)。木霉菌可濕性粉劑處理為將木霉菌可濕性粉劑稀釋300倍進(jìn)行灌根，灌根量為300 mL/株，對(duì)照用等體積的水灌根。灌根時(shí)間為2016年11月4日，21 d后采用對(duì)角線五點(diǎn)取樣法取草莓根際土。

1.2.2 土壤微生物測(cè)序 微生物多樣性研究主要基于編碼核糖體RNA的核酸序列，其中細(xì)菌多樣性研究主要是基于16SrDNA V3+V4區(qū)，真菌多樣性研究主要基于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1區(qū)。提取樣品總DNA，細(xì)菌V3+V4擴(kuò)增采用的引物如下:F，5'－ARACTYCTACGGRAGGCWG －3';R，5'－GACTACNVGGGTATCTAATCC－3'。真菌 ITS1擴(kuò)增引物如下:ZF，5'－AACCTGCGGAAGGATCATT －3';ZR，5'－GARCCAAGAGATCCRTTG－3'。進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測(cè)序文庫(kù)，對(duì)于建好的文庫(kù)先進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫(kù)用Illumina HiSeq 2500進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.2.3 信息分析流程 利用雙末端測(cè)序(paired－end)的方法，構(gòu)建小片段文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。通過對(duì)reads(讀長(zhǎng))拼接過濾，得到優(yōu)化序列(tags)。將優(yōu)化序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units，簡(jiǎn)稱OTUs)聚類，并進(jìn)行物種注釋及豐度分析，以揭示樣品的物種構(gòu)成。進(jìn)一步進(jìn)行α多樣性分析(alpha diversity)，研究單個(gè)樣品內(nèi)部的物種多樣性，統(tǒng)計(jì)各樣品在97%相似度水平下的 Ace、Chao1、Shannon及Simpson指數(shù)。

1.2.4 草莓生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 施用木霉菌可濕性粉劑50 d后，測(cè)定單株葉片數(shù)及單張葉面積，測(cè)定數(shù)量為10株。單張葉面積的測(cè)定參考喬寶營(yíng)等的方法［13］。

1.2.5 草莓灰霉病的調(diào)查 施藥后在生育期內(nèi)定期觀測(cè)連作草莓土傳病害的發(fā)生情況，主要調(diào)查整個(gè)試驗(yàn)處理草莓灰霉病的病株數(shù)，并參照朱虹等方法計(jì)算防效［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測(cè)序結(jié)果評(píng)估

通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件處理各階段樣品序列數(shù)，評(píng)估數(shù)據(jù)質(zhì)量。各樣品測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估結(jié)果如表1、表2所示。

稀釋性曲線(rarefaction curve)用于驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)量是否足以反映樣品中的物種多樣性，并間接反映樣品中物種的豐富程度［15］。由圖1可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著測(cè)序數(shù)的增多，若曲線表現(xiàn)為急劇上升，則表示群落中有大量物種被發(fā)現(xiàn);當(dāng)曲線趨于平緩時(shí)，則表示此環(huán)境中的物種并不會(huì)隨著測(cè)序數(shù)量的增加而明顯增多。稀釋曲線可以作為對(duì)各樣本測(cè)序量是否充分的判斷，如果曲線急劇上升，表明測(cè)序量不足，需要增加序列數(shù);反之，則表明樣品序列充分，可以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。樣品稀釋曲線分別在測(cè)序數(shù)為10 000、20 000條處逐漸趨向平坦，而表1顯示，細(xì)菌的優(yōu)化測(cè)序數(shù)量超過60 000條，表2顯示，真菌的優(yōu)化序列超過40 000條，說明樣品序列充分，測(cè)序數(shù)量合理。

表1 樣品細(xì)菌測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表2 樣品真菌測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.2 OTU 劃分結(jié)果

6個(gè)樣品測(cè)序共獲得479 966對(duì)reads，雙端reads拼接、過濾后共產(chǎn)生301 529條tags，平均每個(gè)樣品產(chǎn)生 43 076 tags。根據(jù)不同的相似度水平，對(duì)所有序列進(jìn)行OTU劃分，在一般情況下，如果序列之間的相似性高于97%就可以把它定義為1個(gè)OTU，每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)1種代表序列［16］。使用QIIME(version 1.8.0)軟件中的UCLUST對(duì)tags在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類，獲得OTU，并基于Silva(細(xì)菌)和UNITE(真菌)分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋。由表3看出，各處理組和對(duì)照組細(xì)菌的總種類數(shù)變化非常小，而真菌種類的數(shù)量差異較大，處理組較對(duì)照組真菌種類總數(shù)明顯減少，降低了 17.57%。

表3 通過聚類得到的不同處理土壤中的OTU數(shù)量

2.3 屬水平豐度變化

由圖2可以看出，細(xì)菌屬水平的豐度變化表現(xiàn)如下:在土壤中，特呂珀菌屬(Truepera)、Chryseolinea、藤黃單胞菌屬(Luteimonas)、鐵礦沙單胞菌屬(Arenimonas)、鞘鞍醇單胞菌屬(Sphingomonas)、冷菌屬(Algoriphagus)和熱單胞菌屬(Thermomonas)豐度較高，處理組和對(duì)照組相比沒有明顯變化。處理組的假單胞菌屬(Pseudomonas)豐度所占比例比對(duì)照增加45.8百分點(diǎn)。假單胞菌屬是土壤中病原菌的拮抗菌，其種類和數(shù)量增多有利于土壤健康［17］。

由圖3可以看出，真菌屬水平豐度的變化表現(xiàn)如下:鐮刀菌屬(Fusarium)在T3處理中豐度占比2.41%，T3處理中其他種類真菌數(shù)量較少，鐮刀菌占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，與往年T3處理是根腐病嚴(yán)重區(qū)有關(guān)。大棚內(nèi)有相同根腐病發(fā)生區(qū)的土壤中，鐮刀菌豐度占比達(dá)3.35%，木霉菌處理后下降28.06百分點(diǎn)。豐度占比前10的頭梗霉屬(Cephaliophora)、赤霉菌屬(Gibberella)、毛殼菌屬(Chaetomium)相對(duì)豐度明顯減少，分別降低245.20、322.53、38.46 百分點(diǎn)，羽蘚屬(Tetracladium)相對(duì)豐度明顯增多，增加348.29百分點(diǎn)。毛殼菌廣泛存在于土壤中，它可以有效降解纖維素和有機(jī)物，對(duì)微生物產(chǎn)生拮抗作用，是廣泛應(yīng)用的生防菌［18］。而木霉菌和毛殼菌互相拮抗，所以會(huì)造成毛殼菌豐度的減少［19］。

2.4 物種豐度聚類熱圖

Heatmap是以顏色梯度來代表數(shù)據(jù)矩陣中數(shù)值的大小并根據(jù)物種或樣品豐度相似性進(jìn)行聚類的一種圖形展示方式。將高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過顏色梯度及相似程度來反映多個(gè)樣品群落組成的相似性和差異性。在熱圖聚類結(jié)果中，顏色代表物種豐度;縱向聚類表示不同物種在各樣品間豐度的相似情況，2個(gè)物種間距離越近，枝長(zhǎng)越短，說明這2個(gè)物種在各樣品間的豐度越相似;橫向聚類表示不同樣品的各物種豐度的相似情況，與縱向聚類一樣，2個(gè)樣品間距離越近，枝長(zhǎng)越短，說明這2個(gè)樣品的各物種豐度越相似。

從圖4可以看出，木霉菌制劑處理的土樣真菌豐度明顯降低，尤其是處理1和處理3。處理2和對(duì)照2橫向聚類豐度相近，縱向聚類豐度差異較大。頭梗霉屬、赤霉菌屬等一些土壤致病菌明顯減少，而圓酵母屬(Torula)、摩西管柄囊霉(Funneliformis)、羽蘚屬(Tetracladium)豐度增加，其中摩西管柄囊霉和羽蘚屬均是菌根真菌，對(duì)土壤健康的保持非常重要。21 d后木霉菌的數(shù)量會(huì)明顯降低。

2.5 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性有 Chao1、Ace、Shannon、Simpson 等多種衡量指標(biāo)［20］。其中Chao1和Ace指數(shù)能簡(jiǎn)單地反映群落中物種的數(shù)量，而不表示群落中每個(gè)物種的豐度信息。Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量群落多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響。Chao1、Ace、Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，說明樣品的物種多樣性越高［21］。另外，本研究還統(tǒng)計(jì)了樣本文庫(kù)的覆蓋率(Coverage)，其數(shù)值越高，則表明樣本中序列被測(cè)出的概率越高，而沒有被測(cè)出的概率越低。該指數(shù)可以反映測(cè)序結(jié)果是否能夠代表樣本中微生物的真實(shí)情況。

從表4、表5可以看出，經(jīng)過木霉菌處理后，土壤微生物多樣性指數(shù)整體上變低，細(xì)菌多樣性指數(shù)變化不大，Ace和Shannon指數(shù)變化較小，Chao1和Simpson指數(shù)略微下降。真菌的多樣性指數(shù)明顯降低，對(duì)照Ace、Chao1、Shannon指數(shù)分別比處理增加 18.51%、18.81、31.03%;對(duì)照 Simpson 指數(shù)比處理降低50.96%。分析原因，可能是由于木霉菌對(duì)細(xì)菌的拮抗性較小，主要拮抗真菌。

2.6 木霉制劑對(duì)草莓植株生長(zhǎng)及灰霉病發(fā)生的影響

施入可濕性粉劑后，分別在生育期內(nèi)進(jìn)行草莓葉片數(shù)量、面積測(cè)定。表6結(jié)果表明:處理組的草莓葉片數(shù)量、葉面積均比對(duì)照組明顯增加。施藥后50 d時(shí)，處理組葉片數(shù)量、葉面積分別比對(duì)照組增加10.78%、10.94%，對(duì)草莓灰霉病的相對(duì)防效達(dá)65%。結(jié)果說明，施入木霉菌對(duì)草莓植株具有明顯的促生長(zhǎng)作用，并對(duì)草莓灰霉病有很好的預(yù)防和治療作用。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用土壤宏基因組高通量測(cè)序的方法研究木霉菌制劑施用后對(duì)土壤微生物多樣性的影響，結(jié)果表明，施用木霉菌對(duì)土壤中細(xì)菌多樣性影響較小，但會(huì)使真菌多樣性明顯降低。木霉菌對(duì)細(xì)菌多樣性的影響主要表現(xiàn)為假單胞菌屬數(shù)量明顯增多;對(duì)真菌多樣性的影響主要表現(xiàn)為頭梗霉屬、赤霉菌屬和毛殼菌屬等數(shù)量明顯減少，酵母菌、羽蘚屬等數(shù)量明顯增多。木霉菌的施用會(huì)造成很多病原菌含量減少，也會(huì)造成一些有益菌含量減少，從而重新塑造土壤的微生態(tài)系統(tǒng)，間接改良土壤，增強(qiáng)植株長(zhǎng)勢(shì)，并減輕灰霉病等土傳病害的發(fā)生程度［22］。

馬建華等報(bào)道，在土壤中施入深綠木霉后細(xì)菌增長(zhǎng)速度緩慢，而真菌數(shù)量顯著降低［23］。古麗君等研究發(fā)現(xiàn)，施入深綠木霉17 d后，真菌的數(shù)量比對(duì)照減少了4×103CFU/g，土壤中細(xì)菌的數(shù)量增加了1.27×1010CFU/g，放線菌數(shù)量沒有明顯變化［24］。另有報(bào)道顯示，木霉菌和假單胞菌屬可以協(xié)同作用，從而提高生防效果［25］。毛殼菌屬是優(yōu)良的生防菌，但木霉菌施用后會(huì)造成其數(shù)量下降，已有報(bào)道顯示兩者互相拮抗［19］。

有關(guān)木霉菌在土壤中存活時(shí)間的問題，當(dāng)前研究結(jié)果不一，康萍芝等研究發(fā)現(xiàn)，施用木霉菌后11 d，木霉菌含量達(dá)到高峰，之后開始降低，55 d后土壤中幾乎檢測(cè)不到木霉菌［26］。杜嬋娟等發(fā)現(xiàn)，施用木霉菌后35 d，木霉菌含量達(dá)到高峰，之后開始下降［27］。古麗君等發(fā)現(xiàn)，木霉在施入25 d時(shí)，相對(duì)含量達(dá)到最低值［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，施用木霉制劑21 d后根際土壤中木霉菌含量已經(jīng)很低，其原因有待進(jìn)一步研究。

表4 細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)

土壤微生物多樣性是衡量土壤健康與否的重要指標(biāo)。木霉菌的施用會(huì)改變土壤中的微生態(tài)系統(tǒng)，往往使一些土傳病害真菌種類和數(shù)量減少，而土壤中有許多真菌往往是重要的病原菌［28］，從而使土壤有益菌和病原菌保持一種動(dòng)態(tài)平衡，達(dá)到抑制病害發(fā)生和促進(jìn)作物生長(zhǎng)的目的。

表5 真菌Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)

表6 木霉制劑對(duì)草莓生長(zhǎng)和灰霉病發(fā)生的影響(施藥后50 d)