王楨璐，姚東林，謝少林，3，范蘭芬，鄒記興，周愛國，3，4

(1.華南農(nóng)業(yè)大學海洋學院，廣東廣州510642;2.廣東省清遠市水產(chǎn)技術推廣站，廣東清遠511510;3.清遠市北江水產(chǎn)科學研究所，廣東清遠511510;4.廣東省清遠市興漁水產(chǎn)科技有限公司，廣東清遠511510)

鯉亞科(Cyprininae)魚類在魚類分類學中屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)。中國鯉亞科魚類共有五屬，分別為鲃鯉屬(Puntioplites Smith)、原鯉屬(Procypris Lin)、鯉 屬 (Cyprinus)、須 鯽 屬 (Carassioides)和 鯽 屬(Carassius)［1］。其中，鯉在華南地區(qū)有華南鯉亞種的分布，華南鯉遍布華南地區(qū)的幾乎所有流域。

目前，對鯉的研究已經(jīng)從傳統(tǒng)形態(tài)學研究轉(zhuǎn)向分子生物學方面的研究。通過對中國鯉中的紅鯉資源進行形態(tài)學、分子遺傳學等方面的研究，獲取了中國6個紅鯉種群的全面數(shù)據(jù)，為紅鯉的育種奠定了基礎［2］。2010年，中國首次完成了鯉魚的全基因組測序;2013年，中國學者從形態(tài)學、染色體組型和同工酶等方面對山東省東平湖的野生鯉魚資源進行了全面研究［3］。這些研究工作為中國鯉亞科魚類的研究提供了堅實基礎。線粒體(mitochondrion)作為真核生物細胞中的一種雙層膜細胞器，為有氧呼吸提供場所，并為細胞提供能量。線粒體存在于細胞質(zhì)中，其內(nèi)部存在一定的遺傳物質(zhì)，因此線粒體DNA為細胞外遺傳物質(zhì)。細胞色素b(Cyt b)和細胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)是常用的線粒體標記基因［4－7］。細胞色素b(Cyt b)基因進化速度適中，其變異主要為轉(zhuǎn)換和顛換，因此在不同科、屬、種中能較好地顯示進化關系，常用于構(gòu)建物種系統(tǒng)發(fā)育關系［8－9］。細胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)作為分子標記具有諸多優(yōu)勢，有足夠的變異且相對保守、有合適的序列長度、可用通用引物擴增和測序等，其分子標記作為DNA條形碼可快速鑒定物種，近年來被廣泛應用于物種鑒定［10－15］。

目前，有關華南鯉的研究資料很少，華南鯉的資源狀況尚不清楚。該研究以線粒體Cyt b和COⅠ基因為分子標記，結(jié)合2個標記各自的進化特點，在每個基因片段獨立分析的基礎上，分析不同地區(qū)華南鯉種群遺傳多樣性，有助于了解其資源現(xiàn)狀，為其資源保護工作提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

該研究華南鯉(Cyprinus carpio rubrofuscus Lacepede)樣品分別采至海南萬泉河(21尾)、珠江水系的高明河(31尾)和廣東榕江(22尾)，共采集74個樣品。樣本采集是隨當?shù)貪O民出船捕撈獲得，剪取新鮮樣品的肌肉和尾鰭組織，加入95%乙醇后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品DNA采用海洋組織提取試劑盒提取(天根生化科技有限公司)、Taq DNA聚合酶采用寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品，試驗中其他試劑均為分析純，測序送至上海英駿公司進行。試驗根據(jù)已經(jīng)報道的鯉科目魚類相關序列，并參考其他文獻的報道，結(jié)合兩者信息用Editseq及Primer premier 5.0 軟件設計引物［14－15］，COⅠ 基因:上游引物 F，5'－ TCA ACCAACCACAAAGACATTGGCAC－3';下游引物 R，5'－TAGAC TTCTGGGTGGCCAAAGAATCA －3'。Cyt b基因，上游引物 F，5'－GACTTGAAAAACCACCGTTG －3';下游引物 R，5'－CCTCAGAAGGATATTTGTCCTC －3'。

1.2 方法

1.2.1 華南鯉基因組DNA提取 取保存于95%乙醇中的樣品80～100 mg，用去離子水沖洗1遍，再放入有去離子水的燒杯中漂洗2 min，用濾紙吸干后置于1.5 mL離心管內(nèi)。先加入50μL裂解液，用剪刀剪碎組織樣品后，再加入450μL裂解液和10μL蛋白酶K用漩渦振蕩器混合20 s，置水浴鍋中55℃恒溫裂解，裂解時間視具體裂解效果而定，一般3～7 h。完全裂解后，按照海洋組織DNA提取試劑盒的操作說明進行提取，提取產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果，后置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 華南鯉Cyt b和COⅠ基因PCR擴增與測序 PCR反應體系總體積為50 μL，包括 dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL，10×buffer 5μL，Taq DNA 聚合酶(1 U/μL)2 μL，上下游引物各1 μL。

PCR反應程序:94℃預變性7 min(Cyt b)和4 min(COⅠ);94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s(Cyt b)和1 min(COⅠ)，35個循環(huán);最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、膠回收(采用TaKaRa凝膠純化試劑盒)后送至上海英駿公司，在ABI 3730自動測序儀上用正向引物進行單向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Chromas 2.23軟件查看序列的測序效果，并以此為依據(jù)判斷測序是否準確。使用MEGA 6.06軟件的Clustal W功能進行序列比對并進行人工矯正，然后計算平均堿基數(shù)、堿基組成比例、簡約信息位點等數(shù)值，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。使用DNASP(版本號為4.5)軟件進行中性假說檢驗(Fu's Fs和Tajima's D算法)和核苷酸分析，并計算平均核苷酸差異值和核苷酸多樣性。使用Allequin V 3.5.1.3軟件分析單倍型多樣性和單倍型組成等。

2 結(jié)果與分析

2.1 華南鯉Cyt b和COⅠ基因的序列組成及變異

該試驗獲得并分析Cyt b和COⅠ基因序列均為52個，其中海南鯉分別為16、19個，珠江鯉17、16個，榕江鯉19、17個。對華南鯉3個種群線粒體Cyt b和COⅠ基因進行序列測定，用Clustal W軟件進行序列比對，人工校正后共得到分析序列長度分別為729 bp(Cyt b)和610 bp(COⅠ)。序列的簡約信息位點數(shù)，T、C、A、G、A+T、C+G 含量見表1。

3個種群Cyt b基因序列共檢測到22個簡約信息位點，其中海南鯉最多，16個樣本共檢測到簡約信息位點10個，海南鯉 T、C、A、G 含量分別為 26.97%、30.42%、28.91%、13.72%，A+T的含量(55.88%)明顯高于 C+G的含量(44.12%);珠江鯉17個樣本共檢測到簡約信息位點4個，T、C、A、G、A+T、C+G 含量分別為 28.48%、29.05%、29.05%、13.43%、57.52%、42.48%;榕江鯉 19 個樣本共檢測到簡約信息位點8個，T、C、A、G、A+T和C+G含量分別為 27.10%、30.28%、28.66%、13.96%、55.76%和 44.24%。

3個種群COⅠ基因序列共檢測到13個簡約信息位點，其中海南鯉19個樣本共檢測到簡約信息位點4個，T、C、A和G 含量分別為 26.94%、29.13%、27.05%、16.89%，A+T 的含量(53.99%)明顯高于C+G的含量(46.02%);珠江鯉16個樣本共檢測到簡約信息位點5個，T、C、A、G、A+T和C+G含量分別為 27.20%、28.88%、27.14%、16.78%、54.34%、45.66%;榕江鯉17個樣本共檢測到簡約信息位點4個，T、C、A、G、A+T、C+G 含量分別為 27.20%、28.86%、27.16%、16.77%、54.37%、45.63%。

表1 華南鯉3個種群Cyt b和COⅠ基因序列特征

2.2 基于Cyt b和COⅠ基因序列對華南鯉種群遺傳距離的分析

應用MEGA 6.06計算該研究的華南鯉3個種群的Kimura雙參數(shù)模型遺傳距離、平均遺傳距離、各種群內(nèi)的平均遺傳距離、兩兩種群間的凈遺傳距離。由表2可知，線粒體Cyt b基因序列的核苷酸分化速率為 2%/百萬年［16－17］，由試驗結(jié)果可知，海南鯉與珠江鯉和榕江鯉的分化年代較遠，大約在2.5萬年和2.65萬年前，而珠江鯉和榕江鯉之間的的分化年代大約在1.5萬年前。

對3個群體間的遺傳分化指數(shù)進行計算發(fā)現(xiàn)，Cyt b和COⅠ基因分析結(jié)果一致，珠江鯉和榕江鯉兩群體間的FST值統(tǒng)計檢驗不顯著(P＞0.05);海南鯉同珠江鯉、榕江鯉兩群體間的FST值統(tǒng)計檢驗均顯著(p＜0.05)。由此可知，珠江鯉和榕江鯉兩群體間的遺傳分化不顯著，而海南鯉同珠江鯉和榕江鯉種群產(chǎn)生了一定程度的遺傳分化。

2.3 基于Cyt b和COⅠ基因序列對華南鯉種群遺傳結(jié)構(gòu)分析

由表3可知，華南鯉3個種群52個樣本共計13個(Cyt b)和12個(COⅠ)單倍型，其中海南鯉有10、5個單倍型，珠江鯉有均7個單倍型，榕江鯉有6、5個單倍型。3個華南鯉種群共同單倍型分別為4、2種，分別為Cyt b基因(Hc3、Hc5、Hc7和Hc8)、COⅠ基因(Hd1和Hd4)。分析Cyt b基因序列發(fā)現(xiàn)，除了4種共有單倍型外，海南鯉和珠江鯉無其他共同單倍型，而與榕江鯉也無其他共同單倍型，此外還有Hc4、Hc6、Hc9、Hc10 4種特有單倍型;珠江鯉除4種共有單倍型外，還與榕江鯉有2種共同單倍型:Hc11和Hc13，Hc12為其特有單倍型。

表2 華南鯉種群間遺傳距離分析

由表4可知，各群體的核苷酸多樣性指數(shù)較低，單倍型多樣性指數(shù)整體均較高。分析Cyt b基因序列單倍型多樣性和核苷酸多樣性可知，海南種群均最高，而珠江、榕江鯉相對較低，其中珠江鯉的核苷酸多樣性(0.002 68)明顯小于海南鯉(0.006 37)。而分析COⅠ基因序列發(fā)現(xiàn)，海南鯉群體的遺傳多樣性(0.003 13)較珠江鯉和榕江鯉(0.003 51)低。通過Tajima's D和Fu's Fs進行中性檢驗，結(jié)果表明華南鯉3個種群內(nèi)的Tajima's D和Fu's Fs值均不具備顯著差異性。

2.4 基于Cyt b和COⅠ基因單倍型序列對華南鯉種群聚類分析

采用Mega 5.0軟件對華南鯉3個種群Cyt b和COⅠ基因單倍型序列進行 NJ聚類分析，bootstrap(重復次數(shù)為1 000)檢驗NJ樹各分支置信度，由圖1可知，各地理種群無序分布于個分支，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的地理聚群、地理結(jié)構(gòu);各種群間沒有明顯的譜系結(jié)構(gòu)。

表3 Cyt b和COⅠ基因序列單倍型及其分布

表4 華南鯉種群的遺傳變異參數(shù)統(tǒng)計

3 分析與討論

3.1 華南鯉種群序列特征分析

線粒體Cyt b和COⅠ基因是目前常用的分子標記，試驗運用序列測定技術分析華南鯉3個種群的Cyt b和COⅠ基因序列特征。脊椎動物線粒體一般特征為“高(A+T)含量且低G含量”［18］，華南鯉3個種群的Cyt b和COⅠ基因序列也符合這一特征，與李青等對星斑川鰈、黃蓋鰈、石鰈，線粒體Cyt b和COⅠ基因序列的研究結(jié)果［19］相符。研究表明，堿基中A+T的含量越高，線粒體DNA的進化優(yōu)勢越明顯［20］。海南鯉、珠江鯉、榕江鯉的 A+T的含量分別為 55.88%、57.52%、55.76%(Cyt b)，53.99%、54.34%、54.37%(COⅠ)，均明顯高于C+G的含量。此外，無論Cyt b還是COⅠ基因的序列，珠江鯉的堿基中A+T含量都是最高的，這表明珠江鯉相對于海南鯉、榕江鯉具有更強的進化優(yōu)勢，可能與珠江鯉處于珠江流域生存環(huán)境有關，珠江作為中國第二大河流，年徑流量大、流經(jīng)地域廣，較海南鯉所處的海南島萬泉河水系和榕江鯉所在的榕江水系更為復雜。

3.2 華南鯉種群遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是物種適應環(huán)境、不斷進化的基礎，一個物種的遺傳多樣性與其進化潛力、適應能力和生存能力密切相關［21－22］。華南鯉3個種群Cyt b基因序列平均遺傳距離為0.003 1，52尾個體檢測出13個單倍型，總?cè)后w單倍型多樣性為0.874，核苷酸多樣性指數(shù)為0.004 15，平均核苷酸差異數(shù)為3.027?；贑OⅠ基因序列的分析表明，3個種群Cyt b基因序列平均遺傳距離為0.003 0，檢測出12個單倍型，總?cè)后w單倍型多樣性為0.770，核苷酸多樣性指數(shù)為0.003 38，平均核苷酸差異數(shù)為1.835。核苷酸多樣性能精確的揭示一個群體線粒體DNA的多態(tài)性程度［23］。研究表明，華南鯉的核苷酸多樣性遠小于南海圓舵鰹的核苷酸多樣性(0.036 81)［24］。當一個群體核苷酸多樣性指數(shù)在 0.001 5 ～0.004 7時，其群體的遺傳多樣性較低［25］。該研究結(jié)果表明，3種華南鯉的遺傳多樣性不高。此外，華南鯉3個種群基于Cyt b和COⅠ基因序列均具有較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性的特征，這與曹艷等對中國南?？凳像R鮫［26］和熊丹等對南海短尾大眼鯛的研究結(jié)果［27］相似，故推測華南鯉近期歷史上有種群快速擴張情況，因此單倍型多樣性會增加，但由于時間不夠長，核苷酸的變異還沒有形成累積效應，故核苷酸多樣性較低。但Tajima's D和Fu's Fs中性檢驗均不具備顯著性差異，則表明華南鯉沒有出現(xiàn)群體擴張，出現(xiàn)這一矛盾的原因可能是該研究的樣品數(shù)量及采樣點較少。

3.3 華南鯉種群的遺傳分化

分析華南鯉Cyt b和COⅠ基因的序列組成及變異發(fā)現(xiàn)，珠江鯉和榕江鯉的A+T含量十分接近，且均較高;而海南鯉的A+T含量均較低?；贑yt b和COⅠ基因序列對華南鯉種群遺傳距離的分析發(fā)現(xiàn)，珠江鯉與榕江鯉之間的遺傳距離均為0.003 0，是3個種群間遺傳差距最小的數(shù)值。而其他兩兩之間的遺傳距離均在0.004 7～0.005 6之間。通過分析華南鯉3個群體的NJ進化樹發(fā)現(xiàn)，3個群體散亂分布于各支，未出現(xiàn)明顯單一的地理聚群;從Cyt b基因的進化樹上可見珠江和榕江2個群體有更多的交集，而海南群體產(chǎn)生了一定的遺傳分化;從COⅠ基因的進化樹上可見珠江和海南種群相對較為集中，與榕江種群均有交集，這些結(jié)果也體現(xiàn)了一定的遺傳進化和地理格局的分布。

Heather等根據(jù)FST大小劃定了群體的分化程度:高度分化，F(xiàn)ST＞0.25;中度分化，0.05 ＜ FST≤0.25;低度分化，0 ＜FST≤0.05，作為群體遺傳分化標準被廣泛認可［28］。在對華南鯉種群遺傳結(jié)構(gòu)的分析中，海南鯉和珠江鯉、榕江鯉2個種群間基于Cyt b基因序列的FST值分別為0.076 9和0.064 2;基于COⅠ 基因序列的FST值分別為0.404 4和0.401 3，均遠高于高度分化標準(0.25);而珠江鯉和榕江鯉間基于Cyt b基因序列的FST值為－0.027 7，基于COⅠ基因序列的FST值為0.003 5，均低于海南鯉和珠江鯉、榕江鯉2個種群間的FST值。

綜上分析，在3個華南鯉種群中，海南鯉相對于其他2個種群遺傳分化較大，而珠江鯉和榕江鯉有較近的遺傳關系，之間的遺傳分化相對較小。另外，珠江鯉和榕江鯉的遺傳分化指數(shù)沒有顯著差異，而同海南鯉的差異顯著，這與3個種群的地理位置有一定關系。珠江鯉所在的珠江水系是華南地區(qū)最大的水系，其每年水量巨大且支流眾多［29］，與榕江鯉所在的榕江水系有一定接觸，2個種群間的交流更加頻繁，故珠江鯉和榕江鯉的遺傳分化指數(shù)差異不顯著。而海南鯉主要分布于海南島，本次試驗所用海南鯉采集于海南島萬泉河水系，所處地區(qū)未受到深度開發(fā)，與外界產(chǎn)生交流少［30］，故同珠江鯉、榕江鯉的遺傳分化指數(shù)差異顯著。