王 洲，王 權，劉美劍

(江蘇農牧科技職業(yè)學院，江蘇泰州225000)

精子超低溫冷凍保存技術能夠長期保持種質資源、保證水產動物遺傳物質的多樣性。該技術已在多種魚類精子保存中得到應用［1］，然而有關鳑鲏精子超低溫冷凍保存技術研究較少［2］，中華鳑鲏精子冷凍保存技術方面還未有報道。本研究根據中華鳑鲏與日本鳑鲏生物學相近，參考日本鳑鲏精子超低溫冷凍保存方法，選取在魚類中運用比較廣泛的二甲基亞砜作為冷凍保護劑［3］，探討了3種不同濃度的DMSO、在不同的冷凍高度、特定高度下不同的保持時間對解凍后精子活力的影響。旨在篩選出一種可以用于中華鳑鲏精子冷凍保存方案，同時為后期進一步優(yōu)化冷凍保存方案、長期保存中華鳑鲏優(yōu)良種質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 鳑鲏與精子的收集 2016年4—5月從江蘇泰州姜堰獲得性成熟的中華鳑鲏個體，置于實驗室水族箱(55 cm×30 cm×40 cm)內暫養(yǎng)1周。其間充氧并保持微流水，同時投喂優(yōu)質飼料對鳑鲏進行營養(yǎng)強化，水溫為18～20℃。取達到性成熟的鳑鲏個體［4－5］，采精時先用干毛巾將鳑鲏魚擦干后，用指尖輕輕按壓鳑鲏腹部，精液從生殖孔中流出，將精液收集到玻璃培養(yǎng)皿中。取少量精液用生理鹽水(5%)激活后在顯微鏡下鏡檢，收集活力超過90%的精液樣本。將來自不同親本的3個精液樣本混合，室溫設定為20℃。

1.1.2 抗凍保護劑與人工精漿 二甲基亞砜(DMSO)具有快速滲透細胞膜的作用，作為冷凍保護劑已經在多種魚類精子研究被證實具有較好的效果［6］。本研究選取3種不同的濃度(5%、10%、15%)的DMSO用于試驗研究。為避免抗凍保護劑添加過程中對精子活力的潛在影響，精液在冷凍前一步加入到人工精漿(ASP)［2］－二甲基亞砜(DMSO)混合液中。ASP－DMSO混合液的配制按表1，試劑配好后用蒸餾水定容至1 000 mL，調節(jié)pH值至8.0。所有試劑均為現(xiàn)用現(xiàn)配，室溫存放時間不超過2 h。

表1 ASP－DMSO混合液配方

1.2 試驗方法

1.2.1 精子激活后活力受時間的影響 為評估精子在水中存活時間，首先對精子動性進行評估，制定精子活力隨時間延長的變化圖。取收集好的精液0.1 mL，加2.0 mL生理鹽水(5%)激活，顯微鏡下對精子動性進行觀察，用血球計數板記錄精子數，統(tǒng)計活力。

1.2.2 精子冷凍 將取自3個不同鳑鲏個體的精液收集好后混合，取0.1 mL精液與2.0 mL ASP－DMSO混合液混合，混合完成后移入0.5 mL的麥管(IMV，法國)，將麥管置于泡沫板上平放，后轉入含有液氮的泡沫箱中保持數分鐘，最終轉入液氮中。泡沫板呈階梯狀，階梯水平面距離液氮表面距離不同用以控制冷凍速率的快慢。為篩選出較優(yōu)的鳑鲏冷凍保存方法，本研究對不同冷凍高度、液氮液面上不同保持時間進行篩選，以篩選出較優(yōu)的冷凍方法。

1.2.2.1 不同冷凍高度對精子解凍后活力的影響 基于已發(fā)表的日本鳑鲏精子冷凍保存的研究［7］，本研究選取精子在加入ASP－DMSO混合液之后在液氮表面上方保持5 min，后轉入液氮中。本試驗設置了4種冷凍高度(麥管置于階梯泡沫上水平放置，距離液氮表面高度分別為5、7、9、11 cm)，以設置不同梯度冷凍速率。

1.2.2.2 精液在液氮液面上保持不同時間的影響 根據以上試驗結果，選取液氮液面以上5 cm作為精子冷凍高度，同時設置液氮液面上4種不同保持時間(4、5、6、7 min)，用以篩選出較優(yōu)的保持時間。根據試驗結果，選取液氮液面上方5 cm，每隔10 s記錄該高度時的溫度(Fluke，美國)，繪制溫度－時間變化曲線圖(圖1)，用以給出試驗時溫度參數。

1.2.3 精子解凍 麥管在投入液氮中保存2 h后，用鑷子小心地取出，立即置于20℃水中解凍20 s。取解凍后的混合液0.1 mL，用2.0 mL生理鹽水稀釋。后用血球計數板對解凍后精子活力進行計數，統(tǒng)計活力。

1.3 數據分析

試驗數據采用“平均值±標準差”表示;數據分析使用SPSS23.0進行單因素方差分析;繪圖使用Excel 2010軟件。

2 結果與分析

2.1 精子激活后活力受時間的影響

由圖1可知，鳑鲏精子激活后動性在所選取各個時間節(jié)點處明顯下降;精子在5 min內能保持較高的活力，5 min后活力明顯下降，10 min后只有少量精子能存活，未發(fā)現(xiàn)有超過13 min的精子。

2.2 不同冷凍高度對精子解凍后活力的影響

由表2可知，液氮液面上方5 cm處冷凍后解凍精子效果較高，其中10%DMSO冷凍后解凍精子動性最高，15%DMSO次之，5%DMSO在此條件下未發(fā)現(xiàn)有解凍后精子游動的現(xiàn)象;其余高度在不同濃度DMSO中冷凍后解凍精子均未發(fā)現(xiàn)具有動性。

表2 精子在不同液面高度保持5 min后轉入液氮冷凍后解凍精子活力

2.3 液氮液面上保持不同時間冷凍對解凍后精子活力的影響

由圖3可知，液氮上方5 cm保持5 min時冷凍后解凍精子能夠獲得較高的動性，高于其他幾組(4、6、7 min);5%DMSO保持4 min后冷凍后解凍觀察到少量精子活動(3.19%)，10%DMSO在保持7 min后冷凍解凍后精子動性較低(1.15%)，其余多數在振動，未發(fā)現(xiàn)游動精子(圖中橫坐標上加粗部分表示解凍后精子動性為零試驗組)。

3 討論

精液超低溫冷凍保存關鍵在于用一定濃度的抗凍保護劑充分滲透入精子內部、使之快速脫水;同時，盡量減少抗凍保護劑毒性對精子的影響。該試驗中，中華鳑鲏在激活后精子保持較高動性(82.25%)時間相對較短(＜5 min)。考慮到后期抗凍保護劑在加入后DMSO的毒性問題，本試驗在收集好精液后直接和ASP－DMSO混合物混合，以防止DMSO在逐步加入過程中局部濃度過大對精子造成損傷;同時減少精子暴露在抗凍保護劑中時間從而降低其毒性。

有別于部分魚類精子玻璃化冷凍保存方案，該試驗采用低速慢凍保存技術。有研究認為，精子冷凍保存在降溫時細胞內外在成冰過程中有冷凍損傷、細胞質變化、細胞骨架等影響［8－10］，影響精子解凍活力。慢速冷凍有助于緩解冷凍過程中胞內外滲透壓急劇變化帶來的生理生化影響，從而提高解凍精子存活率。本試驗在液氮上方5 cm保持5 min，該條件下冷凍速度為19～－75℃/min，后轉入液氮，解凍精子動性高于其他組，該趨勢與日本鳑鲏中的超低溫冷凍結果相似(20 ～ －80 ℃ /min)［7］。

該試驗方法可用于中華鳑鲏基因超低溫冷凍保存，為進一步提高解凍后動性率，還須對抗凍保護劑毒性、冷凍速率、解凍方法進行優(yōu)化。