小花草玉梅高通量轉(zhuǎn)錄組測序與花發(fā)育基因的挖掘

戎利勤，李曉冬，劉虎岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵 712100)

花是被子植物獨(dú)有的觀賞及生殖器官，花發(fā)育的研究對植株發(fā)育及演化過程有重要影響[1]。在擬南芥、金魚草等模式植物中已克隆到許多與花分生組織形成和花器官形成等相關(guān)的基因[2]。Coen等開創(chuàng)性地提出了花器官發(fā)育的ABC模型[3]。但此模型是以核心真雙子葉植物為基礎(chǔ)的。毛茛科屬于基部真雙子葉植物[4]，花器官發(fā)育并不嚴(yán)格遵守基于核心真雙子葉植物的ABC模型，該類群MADS-box基因調(diào)控范圍更廣，延展到相鄰花器官，使花器官形態(tài)具有高度多樣性[5-6]。

小花草玉梅(Anemonerivularisvar.flore-minore)是毛茛科銀蓮花屬草玉梅的變種[7]。小花草玉梅的花器官在野生條件下發(fā)生了變異，變異在花被片、雄蕊和雌蕊中均有體現(xiàn)[8]。根據(jù)其花器官變異部位及程度將變異分為5類：全白、綠白相間、五瓣、全綠和極端變異[9]。

Illumina HiSeq 2000第二代高通量測序平臺(tái)使用PE90技術(shù),在測序速度以及通量方面都得到了優(yōu)化[10]。本研究通過高通量測序技術(shù)Illumina HiSeq 2000，在小花草玉梅中進(jìn)一步挖掘參與其花形態(tài)建成的重要基因。小花草玉梅作為基部真雙子葉植物，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對其變異機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)，為人們更全面研究被子植物的系統(tǒng)發(fā)育與遺傳演化提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2016年7月于陜西省隴縣地區(qū)采集小花草玉梅植株的正?；ㄆ鞴俸妥儺惢ㄆ鞴?，經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃貯存?zhèn)溆谩φ；ㄆ鞴龠M(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析。

1.2 方 法

1.2.1RNA提取與測序文庫的構(gòu)建按照Trizol法提取樣品的總RNA，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。將mRNA打斷成片段后逆轉(zhuǎn)錄成dsDNA，在經(jīng)過純化洗脫之后做末端修復(fù)、加polyA并連接測序接頭，制備測序文庫，富集測序樣本。

1.2.2轉(zhuǎn)錄組測序通過Illumina HiSeq 2000測序平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。為得到較高質(zhì)量的結(jié)果，原始數(shù)據(jù)中要去除帶接頭的，重復(fù)的以及測序質(zhì)量很低的讀序，再用Trinity軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組重頭組裝，先將具有一定長度重疊的reads連成更長的不含N的片段Contig，之后將來自同一轉(zhuǎn)錄本的不同Contig連接，得到兩端不能再延長的非冗余序列。

1.2.3轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析使用BLAST程序，將小花草玉梅unigenes與NCBI的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(Non-redundant protein database，NR)，去冗余的蛋白序列數(shù)據(jù)庫(SwissProt protein database，SwissProt)，蛋白質(zhì)直系同源數(shù)據(jù)庫(Cluster of Orthologous Groups，COG)和基因功能和代謝途徑數(shù)據(jù)庫(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastx比對，得到與給定unigene具有最高序列相似性的蛋白，得到該unigene的注釋信息。根據(jù)NR注釋信息，使用Blast2GO軟件得到基因的基因本體論數(shù)據(jù)庫(Gene Ontology，GO)注釋信息。

1.2.4花發(fā)育基因的實(shí)時(shí)定量PCR試驗(yàn)將轉(zhuǎn)錄組得到的序列與北京大學(xué)的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(Plant TFDB)進(jìn)行比對分析，篩選出了12個(gè)與花發(fā)育相關(guān)的MADS基因。對12個(gè)基因在小花草玉梅正?；ê?種變異花(圖1，B～F)中做定量反應(yīng)。5種變異花分別為全白變異(圖1，B)，綠白相間變異(圖 1，C)，五瓣變異(圖 1，D)，全綠變異(圖 1，E)和極端變異(圖 1，F(xiàn))。利用Primer5設(shè)計(jì)定量PCR引物(表1)，選擇β-actin作為內(nèi)參基因，使用相對定量2-ΔΔCt法分析。運(yùn)用SPSS軟件對基因表達(dá)量進(jìn)行主成分分析，篩選出參與花形態(tài)建成的主要基因。

圖1 小花草玉梅正?；?A)和變異花(B～F)的形態(tài)Fig.1 Morphology of normal (A) and variant flowers (B～F) in Anemone rivularis var. flore-minore

基因Gene正向引物Forward primer(5'→3')反向引物Reverse primer(5'→3')產(chǎn)物長度The length of the product/bpFUL1AAGCATCCAGGGTGGCATGAGCTTCGTCCCGCTGCAGG121FUL2TGATTAAGCATCCAGGGAGGAATCAGAGGTCCAACTGTGAGGAACATGTTCAAATGG180AP3-1CGATCCGCCAGCACCATCGCCATTAACTACTCACACTGAAACAACCAG169AP3-2CCCGACATGCCACTATGGATTCAAGCAAGGGTTAAACCATATGAGCT151AP3-3CATGTTCTCTTGCACCGGCAATCCATCCCAGTCCTTCGCC199PI1ATCGCATAAACAGGAACAGCAGATGGCAAATTTGGCTGGATTGGCTGGACT136PI2GCACCTCCGAAGGATAGTCTGTACTGGACAATGAACCAGCAGGAAATGAA97AG1CCAAATCTAGCAGCAACGGGAGATACGGCCACGGCTAGAG201AG2GACTTGTTCTGACCCACAAACTGCTGGTTTGAGTTCTGCAGAATTTCAATCTGCTG113SEP1CCTTGGAACATTCATAGGGTATGCATCTGCTCCAAGCACCAAAGAACAGAAAAGATGT205SEP3ACATTTGGCTCTGGTCCTCCTCGCCAAACGTAGAAATGGC184AGL6ATCTCCGCCGCAAGGAGCGTCCGATTTGCAAGGTGGGCTC189β-actinGAGCCCAGAGGTGCTCTTAGCAATGCCAGGGAACATGG165

2 結(jié)果與分析

2.1 小花草玉梅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的組裝

對小花草玉梅花器官轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，共得到54 513 822個(gè)讀序(reads)，Q20的百分率為95.49%、Q30的百分率為88.90%、GC含量百分比為46.33%。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，可用于后續(xù)分析。序列組裝后，最終得到了43 767條unigenes，總長度為40 565 399 bp，平均長度與N50分別為926 和1 431 bp。其中，大于2 000 bp的序列共有4 280條，占unigenes總數(shù)的9.78%，說明測序質(zhì)量較好。

2.2 小花草玉梅unigene的功能注釋、分類和代謝途徑分析

使用BLAST程序?qū)y序得到的unigenes分別與NR、Swissprot、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果(表2)顯示，在NR注釋成功的unigenes總unigenes數(shù)的百分率最高(64.09%)，在KEGG注釋成功的unigenes占比則最低，為26.44%。

對4個(gè)數(shù)據(jù)庫的注釋信息分析，共有9 379條unigenes在所有數(shù)據(jù)庫中同時(shí)標(biāo)注成功，占unigenes總數(shù)的21.43%。在所有數(shù)據(jù)中，只在某一個(gè)數(shù)據(jù)庫中注釋成功的unigenes為5 105條，比例為11.66%。在以上4個(gè)數(shù)據(jù)庫中至少1個(gè)數(shù)據(jù)庫注釋成功的unigenes有28 130條。用相似序列匹配得到的近緣物種中，蓮花(Nelumbonucifera)所占比例最高(28.34%)，其次是葡萄(Vitisvinifera,8.53%)，可可(Theobromacacao，5.41%)。

表2 小花草玉梅unigenes的功能注釋結(jié)果

2.3 小花草玉梅的SSR分析

利用MISA軟件在小花草玉梅花器官的unigenes中檢測到5 015個(gè)SSR位點(diǎn)，占unigenes總序列的11.46%。SSR的類型豐富，其中，三核苷酸重復(fù)所占比例最高，達(dá)到了49.77%；五核苷酸重復(fù)所占比例最低，為3.05%；二核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)所占比例分別為27.32%、6.66%和13.20%。在搜索到的SSR中，出現(xiàn)頻率最高的5類基序?yàn)椋篈G/CT(20.7%)、AAG/CTT(15.8%)、ACC/GGT(8.4%)、ATC/ATG(7%)、AGC/CTG(5.1%)。上述SSR特征的分析，有助于開展小花草玉梅花器官的通用性標(biāo)記開發(fā)等研究。

2.4 小花草玉梅花發(fā)育基因的定量實(shí)驗(yàn)

采用qPCR方法，以小花草玉梅正?；閷φ?，設(shè)定基因的表達(dá)量為1，得出各基因的相對表達(dá)量，分別對12個(gè)MIKC 型 MADS-box 基因在小花草玉梅正?；ê妥儺惢ㄖ械谋磉_(dá)量水平進(jìn)行了研究，結(jié)果(圖2)表明，與小花草玉梅正?；ㄏ啾龋?、綠白相間、五瓣變異、全綠變異花中的FUL1、SEP1，SEP3和AGL6基因均顯著上調(diào)表達(dá)，而12個(gè)基因在極端變異花中的表達(dá)水平與正?；ǖ牟町惥幻黠@。

對12個(gè)花發(fā)育基因在正?；ê?種變異花中的表達(dá)量進(jìn)行主成分分析。按特征值>1的原則，提取了3個(gè)主成分，貢獻(xiàn)率分別為41.54%、33.62%、13.45%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)88.61%，涵蓋了大部分信息。由主成分的初始因子載荷矩陣(表3)可以看出，AGL6、SEP3、FUL1、PI2及SEP1的表達(dá)量與第1主成分呈顯著正相關(guān)，AG2、AP3-1、AG1、AP3-3、PI1的表達(dá)量與第2主成分呈顯著正相關(guān)。主成分分析表明，與第1主成分呈顯著正相關(guān)的指標(biāo)，即AGL6、SEP3、FUL1、PI2及SEP1的表達(dá)量均可作為小花草玉梅花形態(tài)發(fā)育的主要指標(biāo)。

圖3是小花草玉梅的12個(gè)花發(fā)育MADS基因的表達(dá)量經(jīng)主成分分析后的前3個(gè)主成分構(gòu)建的三維空間。分析的樣本有6個(gè)，分別為小花草玉梅正?；ê?種變異花。具有不同花形態(tài)的小花草玉梅分布在三維空間中不同的位置。6個(gè)樣品表型不同，各自起主要調(diào)控作用的基因也不相同，因此它們位于空間中的不同位置。

圖3 不同形態(tài)的小花草玉梅在MADS基因三維空間中的分布位置Fig.3 A. rivularis var. flore-minore species placed in 3D space of MADS gene

圖2 12個(gè)MIKC 型 MADS-box 基因在小花草玉梅正?；ê妥儺惢ㄖ械南鄬Ρ磉_(dá)量Fig.2 Relative expression level of 12 MIKC-type MADS genes in normal and variant flowers in A. rivularis var. flore-minore

指標(biāo)Index主成分1Principal component1主成分2Principal component2主成分3Principal component3FUL10.860.450.13FUL20.570.510.30AP3-10.140.80-0.32AP3-20.450.26-0.80AP3-3-0.240.770.57PI1-0.630.760.10PI20.850.39-0.08AG1-0.500.790.23AG20.180.85-0.19SEP10.75-0.400.45SEP30.90-0.170.35AGL60.930.13-0.12特征值 Eigenvalue4.9854.0341.614貢獻(xiàn)率 Contribution rate/%41.53833.62013.446累計(jì)貢獻(xiàn)率Cumulative contribution rate/%41.53875.15888.604

3 討 論

Illumina高通量測序技術(shù)的測序數(shù)據(jù)量大、效率高且成本低[11]。本研究共得到43 767條unigenes，平均長度為926 bp，高于薏苡幼苗葉片737.85 bp[12]、半夏珠芽751 bp[13]，梁山慈竹857.89 bp[14]，說明小花草玉梅序列組裝效果較好。N50值為1 431 bp，N50值越大說明組裝得到的長片段就越多，組裝效果就越好[15]；Q20的百分率為95.49%、Q30的百分率為88.90%、高于它們的規(guī)定限值(>80%)，以上研究結(jié)果表明，本研究采用的雙端測序的方法，增加了測序深度，且提高了拼接的效率和準(zhǔn)確性[16]。此次測序質(zhì)量可靠，可以滿足轉(zhuǎn)錄組分析的基本要求。

將測序結(jié)果分別與NR、Swissprot、KOG、KEGG數(shù)據(jù)庫比對，得到每個(gè)數(shù)據(jù)庫注釋的unigenes占總unigenes分別為64.09%、48.21%、39.85%和26.44%。在以上4個(gè)數(shù)據(jù)庫中至少在1個(gè)數(shù)據(jù)庫注釋成功的unigenes占比為64.27%。有35.73%的unigenes未得到注釋，一方面可能是因?yàn)閡nigenes序列片段長度過短，或是非編碼序列，難以進(jìn)行同源性比對；另一方面，小花草玉梅基因組和轉(zhuǎn)錄組遺傳信息匱乏，某些未被注釋的基因可能是其特有的基因。將數(shù)據(jù)在NR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)unigenes(28.34%)能夠成功匹配到蓮花的蛋白質(zhì)序列，其次是葡萄(8.53%)和可可(5.41%)，這可能與目前NCBI數(shù)據(jù)庫中蓮花、葡萄和可可的基因組數(shù)據(jù)比較豐富有關(guān)。

在黑種草中，有研究者通過基因敲除技術(shù)來研究花器官形成機(jī)制，研究表明決定花器官特征的基因有AP3-1、AP3-2、AP3-3、PI1、PI2、AG1、SEP1、SEP2、SEP3和AGL6，它們表達(dá)量的不同會(huì)影響花形態(tài)的建成[17]。本研究中的小花草玉梅花器官在野生條件下發(fā)生了變異，王超等的研究將變異分為5類,分別為全白變異、綠白相間變異、五瓣變異、全綠變異和極端變異。張婷等研究發(fā)現(xiàn)，正常植株和綠白相間變異植株的AP3-3基因序列是不同的，在變異植株的上游調(diào)控區(qū)有一段49 bp的插入；突變植株的AP3-3序列與正常相比有4個(gè)堿基突變點(diǎn)[18]。參照前人對小花草玉梅的研究，本研究選取了12個(gè)花發(fā)育相關(guān)的MADS基因分別在小花草玉梅正?；ê?種變異花中做實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)，通過主成分分析表明，AGL6、SEP3、FUL1、PI2及SEP1的表達(dá)量為小花草玉梅花形態(tài)建成的主要影響指標(biāo)。

本研究首次建立了小花草玉梅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，有助于其分子遺傳信息的大量擴(kuò)充，初步挖掘了12條花發(fā)育相關(guān)的MADS基因，為進(jìn)一步研究小花草玉梅花形態(tài)發(fā)育及變異的分子機(jī)制，開展花發(fā)育的基因克隆及功能驗(yàn)證等研究提供了寶貴資源。