桉樹根系共生真菌的分離與鑒定

王思佳，賴文珍，謝賢安，陳 輝，唐 明，胡文濤

(華南農(nóng)業(yè)大學 廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室，林學與風景園林學院，廣州 510642)

桉樹是桃金娘科(Myrtaceae)桉屬(Eucalyptus)植物的統(tǒng)稱，屬常綠高大喬木，具有生長速度快、樹干通直、適應(yīng)性強等特點，是中國南方主要的造林樹種[1]。南方酸性紅壤和磚紅壤中磷成分主要為磷酸鋁、磷酸鐵和磷酸鈣，有效磷含量低，引起桉樹生長緩慢，某些組織發(fā)生畸變等現(xiàn)象[2]。為此，大多桉樹栽培區(qū)通過施用化肥來提高桉樹生長量，而化肥又會導致土壤理化性質(zhì)不斷加劇惡化，土壤質(zhì)量下降。加之南方土壤呈酸性，磷肥很難被植物吸收，最終導致桉樹缺磷現(xiàn)象嚴重，長期使用化學肥料，不僅會對周圍環(huán)境造成污染，還會導致土壤肥力退化[1]。

菌根(mycorrhiza)是土壤中某些真菌與植物根系形成的共生體，具有促進植物吸收水分和磷素等礦質(zhì)營養(yǎng)，提高植物生長量，增強植物抗逆能力和改良森林土壤結(jié)構(gòu)特性等重要作用[3-5]。外生菌根(ectomycorrhizas，ECM)和叢枝菌根(arbuscular mycorrhiza，AM)是林木菌根的主要類型[5]。深色有隔內(nèi)生真菌(dark septate endophytic fungi，DSE)廣泛存在于植物根圍，是一類能夠定殖在植物根系的真菌類群，被認為是“特殊的菌根菌”[6]，并且能夠與菌根真菌共同存在于植物根系中[7-8]。

桉樹是既可以形成AM，又可以形成ECM的樹種[9]。AM真菌可以在一定程度上提高桉樹對磷的高效利用，并且能夠緩解桉樹受到土壤中鋁離子的毒害[5]。ECM真菌對桉樹青枯病的生物防治有重要意義[10]。朱天輝等[11]對四川省范圍內(nèi)的巨桉(Eucalyptusgrandis)、尾葉桉(Eucalyptusurophylla)、藍桉(Eucalyptusglobulus)、大葉桉(Eucalyptusrobusta)ECM真菌調(diào)查，發(fā)現(xiàn)9科11屬17種ECM真菌，梁洪萍[12]在四川省內(nèi)的巨桉發(fā)現(xiàn)7科、10屬、17種ECM真菌，但這些ECM真菌多為野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，與桉樹的共生效應(yīng)研究很少。為發(fā)掘優(yōu)良的桉樹共生真菌資源，本研究通過對桉樹根系真菌侵染率的測定和真菌的分離鑒定，將真菌回接桉樹，經(jīng)柯赫氏法則(Koch's Rule)確定桉樹共生真菌，為進一步研究共生真菌促進桉樹生長、增加磷素營養(yǎng)吸收的機制，以及應(yīng)用共生真菌提高桉樹造林成活率、生物量和木材產(chǎn)量提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

尾葉桉、窿緣桉(Eucalyptusexserta)和尾巨桉(E.urophylla×E.grandis)采自華南農(nóng)業(yè)大學樹木園和增城教學科研基地，位于N23°09′10″～23°14′22″，E113°20′22″～113°37′56″，屬于亞熱帶季風氣候和亞熱帶海洋性氣候，土壤為赤紅壤。2017年11月采集樣品，在樹冠的投影區(qū)內(nèi)取30～40 cm范圍內(nèi)土層的樹木側(cè)根作為根樣，將根上的大塊泥土輕輕抖掉，其余泥土連同根系一起裝入密封袋中，同種桉樹放入同一密封袋中，封口標記。根樣帶回實驗室后，一部分用于立即觀察根系的形態(tài)結(jié)構(gòu)和共生真菌的分離，另一部分用于侵染率的測定。

1.2 試驗方法

1.2.1共生真菌的侵染率統(tǒng)計將采集的根樣沖洗干凈，采用透明壓片法對根系進行透明、酸化、臺盼藍染色和脫色后，在顯微鏡下統(tǒng)計菌根侵染情況[13]，參照Trouvelot 等[14]的方法統(tǒng)計AM真菌和ECM真菌的侵染率及侵染強度。

1.2.2共生真菌的分離培養(yǎng)采用組織分離法分離真菌。將根系洗去泥土，剪成1～2 cm根段，在體式顯微鏡下找出帶有共生真菌結(jié)構(gòu)的根尖，經(jīng)3%次氯酸鈉表面消毒2～3 min，無菌水中沖洗后，剪成0.5～1 cm的根段，置入PDA培養(yǎng)基內(nèi)，25 ℃恒溫倒置培養(yǎng)[5]。

待培養(yǎng)基內(nèi)長出菌絲后進行純化，經(jīng)過純化后的菌株一部分進行插片培養(yǎng)[15]，待菌絲長到玻片中部，用于真菌的形態(tài)學鑒定。另一部分純化菌株接種到PDA斜面，4 ℃冰箱保存，用于分子鑒定。

1.2.3真菌的形態(tài)學鑒定觀察菌落的表面特征、形狀、顏色、大小、光滑度等菌落特征，記錄其生長狀況。顯微鏡下觀察菌絲的顏色、是否分隔、分枝情況；觀察分生孢子的形狀、顏色、大小、細胞壁特征、有無子囊(擔子)及子囊孢子(擔孢子)等特征。根據(jù)真菌分類文獻，并參閱近幾年有關(guān)真菌鑒定的文獻對分離菌株進行形態(tài)學鑒定[16-18]。

1.2.4真菌的分子生物學鑒定將純化的真菌在25 ℃培養(yǎng)2周后，收集新鮮菌絲進行ITS序列分析。參照Zhou等[19]研究方法，采用真菌DNA微量提取試劑盒(Omega公司，D3195-01)提取DNA。ITS序列擴增引物選擇真菌ITS區(qū)通用引物ITS1-F和ITS4(ITS1-F: CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC)[20]，由生工生物技術(shù)有限公司合成。

通過PCR反應(yīng)擴增真菌ITS rDNA基因。反應(yīng)體系20 μL[10 μL Premix Tap(Sangon Biotech)、0.5 μL ITS4、0.5 μL IFS1-F、1 μL PCR產(chǎn)物和8 μL ddH2O]。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火25 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最終72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳(100 V，40 min)，采用膠回收試劑盒(OMEGA公司，D2500)進行PCR產(chǎn)物回收?；厥债a(chǎn)物采用TaKaRa公司pMD18-T試劑盒進行T/A連接并克隆轉(zhuǎn)化。連接反應(yīng)體系5 μL(2 μL pMD18-T、0.5 μL Insert DNA和2.5 μL Solution Ⅰ)，37 ℃培養(yǎng)過夜，送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行雙向測序。

將真菌測序所得的ITS序列在NCBI中運用BLAST工具進行比對分析，并從NCBI中下載已知同源序列，用軟件MEGA(Version 5.1)進行比對，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用Maximum Composite Likelihood 方法計算Bootstrap值，估測系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度。

1.2.5共生真菌的回接將沙子、蛭石(體積比為1∶1)在121 ℃滅菌60 min，裝滿體積為0.3 L的花盆中，參考劉茂軍等[21]的方法并做適當修改，將分離出的共生真菌回接到巨桉組培苗(來自中國林業(yè)科學研究院熱帶林業(yè)研究所)，每株接種20個直徑5 mm的菌餅，每組3個重復。將接種好的植株套袋，在組培室內(nèi)培養(yǎng)(溫度25 ℃，濕度60%，光強5 000 Lux)，半個月后取下套袋；定期澆水，2個月后，收獲接種苗，檢測根系共生真菌的定殖情況并測定侵染率。

2 結(jié)果與分析

2.1 共生真菌侵染率統(tǒng)計

觀察到尾葉桉、窿緣桉和尾巨桉均能被菌根真菌侵染，其中窿緣桉的AM真菌侵染率最高，達到58.75%，侵染強度14.54%；其次是尾巨桉，AM真菌侵染率為51.33%，侵染強度15.74%；尾葉桉最低，侵染率為48.67%，侵染強度為11.03%(表1)。與AM真菌侵染率相比，ECM真菌的侵染率相對較低，尾葉桉、尾巨桉和窿緣桉3種桉樹的ECM真菌侵染率依次為11.03%、13.02%和15.00%，侵染強度為1.64%、1.60%和0.81%(表1)。經(jīng)方差分析，尾葉桉、窿緣桉和尾巨桉3種桉樹AM真菌總侵染率差異不顯著(P>0.05)，ECM真菌總侵染率差異也不顯著(P>0.05)。

對3種桉樹共生真菌侵染特征觀察，發(fā)現(xiàn)尾葉桉(圖1，A～C)和尾巨桉(圖1，D～F)都同時具有AM真菌結(jié)構(gòu)、ECM真菌結(jié)構(gòu)和DSE結(jié)構(gòu)，窿緣桉具有AM真菌結(jié)構(gòu)(圖1，G)和ECM真菌結(jié)構(gòu)(圖1，H、I)。3種桉樹的AM真菌結(jié)構(gòu)和ECM真菌結(jié)構(gòu)都比較明顯，典型的深色有隔內(nèi)生真菌結(jié)構(gòu)在尾葉桉和尾巨桉都有觀察到。

尾葉桉、窿緣桉和尾巨桉3種桉樹根尖均存在外生菌根的菌套結(jié)構(gòu)(圖2)。但3種桉樹的外生菌根形態(tài)不同，其中尾巨桉為單軸分枝狀(圖2，A)，窿緣桉為單軸分枝和二叉分枝(圖2，B、C)，尾葉桉的菌根形態(tài)呈二叉分枝狀(圖2，D～F)。外生菌根的菌根形態(tài)特征是鑒定外生菌根真菌的依據(jù)之一，說明外界自然環(huán)境下，本研究采樣點的尾巨桉和尾葉桉分別與1種外生菌根真菌形成菌根，窿緣桉與2種外生菌根真菌形成菌根。

表1 桉樹根系菌根真菌侵染狀況

A～C.尾葉桉；D～F. 尾巨桉；G～I.窿緣桉；a. 菌套結(jié)構(gòu)；b. 深色有隔內(nèi)生真菌；c. 根內(nèi)菌絲；d. 叢枝結(jié)構(gòu)；e. 泡囊；f. 根外菌絲圖1 桉樹根系中的菌絲結(jié)構(gòu)A-C. Eucalyptus urophylla；D-F. E. urophylla × E. grandis；G-I.Eucalyptus exserta; a. Mantle；b. Dark septate endophytes；c. Internal hyphae；d. Arbuscule；e. Vesicle；f. External hyphaeFig.1 Mycelium structure in Eucalyptus roots

圖2 桉樹根系外生菌根真菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.2 Ectomycorrhizas in Eucalyptus roots

2.2 桉樹共生真菌的形態(tài)特征

從3種桉樹根系共分離出6株共生真菌，標記為WY1、WY3、WY9、LY1、WJ1、WJ5。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d，形成的菌落顏色呈白色、淡黃色或者深灰色；形狀為圓形或橢圓形；菌絲致密或稀疏(圖3)；其中WY1生長速度最快，25℃恒溫培養(yǎng)20 d菌落直徑為9 cm，最快長滿平板；其次為WY3、WJ5和LY1，菌落直徑分別為8.5 cm、8.6 cm和9 cm；WY9和WJ1則生長比較緩慢，菌落直徑為5.4 cm和4.4 cm。插片培養(yǎng)的蓋玻片置于載玻片上，顯微鏡觀察的菌絲形態(tài)(圖4)，菌落特征和形態(tài)特征描述見表2。

從PDA培養(yǎng)基的菌落特征(圖3)以及顯微鏡下的菌絲形態(tài)觀察(圖4)，可以看出WJ5、WY3、WY9和LY1的菌落顏色呈深色，菌絲有隔，都具有典型的深色有隔內(nèi)生真菌的特征，初步推斷為DSE。而WY1和WJ1的菌落呈白色，菌絲無色，推測屬于擔子菌亞門(Basidiomycotina)。參照真菌形態(tài)和分類描述的特征，鑒定出WY3為莖點霉屬(Phomasp.)，WY9為鐮刀霉屬(Fusariumsp.)，LY1為擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)，WY1為小皮傘屬(Marasmiussp.)，WJ1為裸腳傘屬(Gymnopussp.)，WJ5為傘狀霉屬(Umbelopsissp.)。

A. WY1；B. WY3；C. WY9；D. WJ1；E. WJ5；F. LY1圖3 分離菌株在PDA培養(yǎng)基上生長20 d后的菌落形態(tài)Fig.3 The isolated fungus colonies on PDA medium after 20 days

A. WY1；B. WY3；C～D. WJ5；E～G. LY1；H. WJ1；I. WY9圖4 分離的真菌的菌絲和孢子形態(tài)Fig.4 The mycelium and spore morphology of isolated fungi

2.3 共生真菌的分子鑒定

提取根系共生真菌DNA后，利用引物ITS1-F和ITS4，對提取的DNA菌液進行PCR擴增，在凝膠成像系統(tǒng)中看到清晰的條帶(圖5)。將真菌測序所得的ITS序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫后，在線運用BLAST工具進行比對，結(jié)果顯示：WY1和WJ1與GenBank中的JN943601.1和MF100988.1菌株有95%以上的相似度，結(jié)合形態(tài)特征確定它們?yōu)閾泳鷣嗛T中不同屬的2種外生菌根真菌，分別為三色小皮傘菌(M.tricolor)和黑柄裸腳傘(G.melanopus)；WY3、WY9、WJ5和LY1分別與GenBank中莖點霉屬、鐮刀霉屬、二型傘霉(U.dimorpha)和芒弗里亞擬盤多毛孢(P.mangifolia)有94%以上的相似度(表3)。

將真菌測序所得的ITS序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，運用BLAST工具進行比對，并從NCBI下載GenBank數(shù)據(jù)庫內(nèi)已知同源序列，用軟件MEGA(Version 5.1)進行對比分析，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)，可以看到，6株真菌(紅色☆標出)分為3個類群，隸屬于擔子菌亞門、接合菌亞門(Zygomycotina)和半知菌亞門(Deuteromycotina)。其中擔子菌亞門單獨成一類群，包括WY1和WJ1；接合菌亞門包括WJ5；WY3、WY9和LY1同屬半知菌亞門，其中LY1和WY9有極高的相似度。

表2 真菌菌落特征和形態(tài)特征

表3 桉樹根系共生真菌rDNA ITS序列Blast比對結(jié)果

圖5 分離真菌DNA的PCR產(chǎn)物1%瓊脂凝膠電泳Fig.5 PCR products of isolated fungi on 1% agar gel electrophoresis

綜合形態(tài)特征和ITS序列分析，確定6種真菌隸屬3亞門5目6科6屬。其中，半知菌亞門、瘤座孢菌目(Tuberculariales)、瘤座孢菌科(Tuberculariaceae)、鐮刀霉屬，分離自尾葉桉；球殼孢目(Sphaeropsidales)、球殼孢科(Sphaerioidaceae)、莖點霉屬，分離自尾葉桉；黑盤孢菌目(Melanconiales)、黑盤孢菌科(Melanconiaceae)、擬盤多毛孢屬、芒弗里亞擬盤多毛孢，分離自窿緣桉。擔子菌亞門、傘菌目(Agaricales)、小皮傘科(Marasmiaceae)、裸腳傘屬、黑柄裸腳傘，分離自尾巨桉；白蘑科(Tricholomataceae)，小皮傘屬、三色小皮傘菌，分離自尾葉桉。接合菌亞門、毛霉目(Mucorales)、傘狀霉科(Mucoraceae)、傘狀霉屬、二型傘霉，分離自尾巨桉。

圖6 基于18S rDNA ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Neighbor-joining phylogenetic tree based on 18S rDNA ITS sequences

A～B. 三色小皮傘菌；C～D. 芒弗里亞擬盤多毛孢；E～F. 二型傘霉；G. 鐮刀霉屬；H. 黑柄裸腳傘；I. 莖點霉屬a. 根外菌絲；b. 深色有隔內(nèi)生真菌；c. 微菌核；d. 根內(nèi)菌絲圖7 分離的真菌在回接根系上形成的菌絲結(jié)構(gòu)A-B. M. tricolor；C-D. P. mangifolia；E-F. U. dimorpha；G. Fusarium sp.；H. G. melanopus；I. Phoma sp.a. External hyphae；b. Dark septate endophytes；c. Microsclerotia；d. Internal hyphaeFig.7 Mycelium structures of isolated fungi formed in re-inoculated roots after 60 days

A～D.三色小皮傘菌；E、F.黑柄裸腳傘圖8 回接根系上的外生菌根形態(tài)A-D. M. tricolor; E-F. G. melanopusFig.8 Ectomycorrhizas formed in re-inoculated roots of Eucalyptus after 60 days

2.4 真菌回接桉樹的侵染效應(yīng)

2.4.1真菌與桉樹共生效應(yīng)6種真菌回接巨桉組培苗后菌絲侵染情況顯示，莖點霉屬、鐮刀霉屬、二型傘霉和芒弗里亞擬盤多毛孢4種真菌形成深色有隔菌絲和微菌核(microsclerotia)結(jié)構(gòu)(圖7)，推測它們?yōu)镈SE，微菌核豐富度分別為46.8%、42.3%、56.7%和62.3%。三色小皮傘菌和黑柄裸腳傘2種真菌形成外生菌絲及菌套結(jié)構(gòu)，確定為桉樹外生菌根真菌(圖8)。

2.4.2回接后侵染率統(tǒng)計6種真菌回接無菌巨桉組培苗，測定侵染率發(fā)現(xiàn)，6種真菌均能在巨桉根內(nèi)侵染，其中莖點霉屬的侵染率最高(52.2%)，其次為黑柄裸腳傘(侵染率為45.3%)，三色小皮傘菌、鐮刀霉屬、二型傘霉和芒弗里亞擬盤多毛孢的侵染率分別為30%、32.2%、33.2%和22.1%。

3 討 論

桉樹是典型的既可以形成叢枝菌根(AM)，又可以形成外生菌根(ECM)的樹種[5]，甚至外生菌根、叢枝菌根和兩者混合菌根同時存在[22]，本研究在尾葉桉、窿緣桉和尾巨桉3種桉樹除了觀察到有ECM結(jié)構(gòu)和AM真菌結(jié)構(gòu)，同時，在尾葉桉和尾巨桉中還觀察到典型的深色有隔內(nèi)生真菌結(jié)構(gòu)，說明桉樹菌根真菌具有多樣性，不僅是前人報道的可以與AM真菌、ECM真菌形成混合菌根，還可以和DSE形成共生體系。

本研究在桉樹根系中首次報道2種ECM真菌，三色小皮傘菌和黑柄裸腳傘。弓明欽等[23]對華南地區(qū)桉樹ECM真菌的調(diào)查發(fā)現(xiàn)11種，優(yōu)勢菌為多根硬皮馬勃(SclerodermapolyrhizumPers)；朱天輝等[11]和梁洪萍[12]分別發(fā)現(xiàn)四川桉樹有17種ECM真菌，都與本次分離到的2種ECM真菌不同，不同樹種、不同生態(tài)環(huán)境會影響菌根真菌的種類和多樣性。三色小皮傘菌具有產(chǎn)漆酶的特性，漆酶屬于木質(zhì)素降解酶類，可參與植物細胞壁的形成，還可去木質(zhì)素，在環(huán)境修復、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域用途廣泛[24]；黑柄裸腳傘為中國新紀錄種[25]，其生物學特性有待進一步研究。

在桉樹根系中分離得到4種內(nèi)生真菌，回接后均觀察到DSE典型的深色有隔菌絲和微菌核結(jié)構(gòu)，推測它們?yōu)殍駱涓抵械腄SE，有待于進一步的研究。莖點霉屬、擬盤多毛孢屬和鐮刀霉屬是桉樹中具有一定抗菌作用的內(nèi)生真菌[26]，謝玲等[27]在甘蔗(Saccharumofficinarum)根圍發(fā)現(xiàn)深色有隔內(nèi)生真菌莖點霉屬，韋繼光[28]從南山茶(Camelliasemiserrata)和短葉羅漢松(Podocarpusmacorphyllus)中分離出芒弗里亞擬盤多毛孢；格希格圖等[29]在桉樹根系中發(fā)現(xiàn)鐮刀菌(Fusarium)的存在，徐超等[30]發(fā)現(xiàn)二型傘霉可提高鐵皮石斛生長速度和增強抗旱能力。