甜菜堿在微生物中的代謝及應用研究進展

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(1.天津科技大學 生物工程學院，天津 300457；2.蓮花健康產(chǎn)業(yè)集團股份有限公司 博士后科研工作站，河南 項城 466200)

甜菜堿是甘氨酸的三甲基化衍生物，幾乎存在于所有的生物體中.自從1982年Galinski等[1]首次報道細菌Halorhodospirahalochloris利用甜菜堿之后，在許多微生物中相繼發(fā)現(xiàn)了甜菜堿的生物合成和利用.大多數(shù)嗜鹽細菌和耐鹽細菌，包括一些生活在高滲環(huán)境中的光合自養(yǎng)藍藻和硫細菌，可以合成甜菜堿并用作有效的滲透劑[2].大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和球形節(jié)桿菌等異養(yǎng)細菌也可以自身合成甜菜堿[3].大多數(shù)異養(yǎng)細菌不能合成甜菜堿，但可以吸收和利用環(huán)境中的甜菜堿對抗?jié)B透脅迫，例如在根瘤菌科Rhizobiaceae家族發(fā)現(xiàn)的代表性菌株[4].最近，在真菌類微生物中也發(fā)現(xiàn)了甜菜堿的生物合成途徑.在煙曲霉中，甜菜堿不參與應激調(diào)節(jié)，僅在膽堿分解代謝中起著代謝中間體的作用，并可用作營養(yǎng)物質(zhì)[5].甜菜堿不僅對天然微生物群有功效，而且對工業(yè)微生物發(fā)酵也有顯著效果.甜菜堿的使用提高了工業(yè)生產(chǎn)過程中菌株的發(fā)酵性能，例如，甜菜堿的添加可以有效提高乳酸菌在脫水、貯存和復溶過程中的存活率[6].總之，微生物普遍將甜菜堿作為一種應激保護劑或關(guān)鍵代謝中間體加以利用.在這篇綜述中，筆者總結(jié)了多種微生物中甜菜堿的生物合成、轉(zhuǎn)運和分解代謝的共同特征.此外，本綜述提供了甜菜堿在微生物發(fā)酵中的最新研究進展，并討論了其在生物技術(shù)領域的應用前景.

1 微生物中甜菜堿的生物合成途徑

與動植物類似，大多數(shù)微生物通過利用兩種酶(膽堿脫氫酶和甜菜堿醛脫氫酶)兩步氧化膽堿合成甜菜堿(圖1).然而，在微生物中已經(jīng)鑒定出另一種生物合成途徑，即利用甘氨酸經(jīng)過三步甲基化合成甜菜堿(圖1)，在動植物相關(guān)研究中尚未有該途徑的報道.

圖1 微生物中甜菜堿的生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis of betaine in microorganisms

1.1 膽堿氧化途徑

在大多數(shù)微生物細胞中甜菜堿通過膽堿兩步氧化法合成.不同微生物中，第一步氧化反應涉及的酶(催化膽堿到甜菜醛)是具有多樣性的.在大腸桿菌中，膽堿脫氫酶催化膽堿的第一步氧化反應，該酶與膜結(jié)合，需要FAD參與并使用氧作為電子受體[7].在枯草芽孢桿菌中，第一步氧化反應則由不同的膽堿脫氫酶催化，該酶為NAD+依賴的III型醇脫氫酶，利用NAD+作為電子受體[3].在煙曲霉中，膽堿氧化酶催化第一氧化步驟，并使用氧作為電子受體[5].

相比之下，不同微生物中第二步氧化反應涉及的酶是相對保守的.在細菌和真菌中廣泛存在可溶性的NAD+依賴的甜菜醛脫氫酶，該酶可以使用NAD+作為電子受體將甜菜醛氧化成甜菜堿[3,5,7].

1.2 甘氨酸甲基化途徑

一些微生物可以通過甘氨酸甲基化合成甜菜堿(圖1).體外14C標記實驗表明：S-腺苷甲硫氨酸可以作為甲基供體用于甘氨酸到肌氨酸，肌氨酸到二甲基甘氨酸以及二甲基甘氨酸到甜菜堿的轉(zhuǎn)化過程[9].該途徑已經(jīng)在古細菌Methanohalophilusportucalensis、藍藻Aphanothecehalophytica、光致硫細菌Ectothiorhodospirahalochloris、嗜鹽放線菌Actinopolysporahalophile、嗜鹽光養(yǎng)菌H.halochloris和藍細菌Synechococcussp.WH8102中發(fā)現(xiàn).已經(jīng)從上述微生物中分離并鑒定出甘氨酸甲基化反應涉及的三種酶，包括甘氨酸肌氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(GSMT)、肌氨酸二甲基甘氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(SDMT)和二甲基甘氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(DMT)[10-12].

從甘氨酸合成甜菜堿是微生物中罕見的代謝途徑，因為甲基化反應是自然界中最耗能的過程之一，如S-腺苷甲硫氨酸的一分子活性甲基的形成需要消耗細胞12分子的ATP[13].在微生物體內(nèi)存在如此耗能的途徑可能與以下原因有關(guān)：1) 一些甜菜堿依賴性的厭氧微生物不能進行氧依賴性膽堿氧化，例如嗜鹽甲烷菌M.portucalensis無法在胞內(nèi)進行膽堿的氧化；2) 一些甜菜堿依賴性的微生物不表達膽堿氧化酶基因，如光合細菌E.halochloris；3) 一些極端嗜鹽微生物同時含有膽堿氧化和甘氨酸甲基化途徑，例如嗜鹽放線菌在膽堿含量較低的環(huán)境中可以使用耗能的甲基化途徑緊急合成甜菜堿.

2 微生物中甜菜堿的轉(zhuǎn)運途徑

甜菜堿及其前體膽堿是自然界中普遍存在的化合物.這些化合物被微生物利用于抵御環(huán)境脅迫[14].考慮到甜菜堿合成需要消耗能量，從環(huán)境中直接攝取甜菜堿是一種更為經(jīng)濟合理的方式.

細菌和古細菌演化出一整套運輸甜菜堿等相容性溶質(zhì)的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，以滿足不同環(huán)境下的生理需求.由于甜菜堿和其他相容性溶質(zhì)的主要功能為滲透保護，所以這些轉(zhuǎn)運系統(tǒng)通常在高滲透壓下才會發(fā)揮作用.滲透壓的變化會引起相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄變化.其中，一些轉(zhuǎn)運系統(tǒng)可能對特定的底物(包括甜菜堿等)表現(xiàn)出高親和力，而一些轉(zhuǎn)運系統(tǒng)則展現(xiàn)出廣泛的底物特異性并允許細胞利用環(huán)境中存在的一系列相容性溶質(zhì)[15].表1中總結(jié)了兩類代表性的甜菜堿轉(zhuǎn)運蛋白、初級轉(zhuǎn)運蛋白(也稱ABC轉(zhuǎn)運蛋白)和次級轉(zhuǎn)運蛋白.

表1 微生物中的甜菜堿轉(zhuǎn)運蛋白Table 1 Betaine transporters in microorganisms

3 微生物中甜菜堿的分解代謝途徑

微生物中存在不同的甜菜堿分解代謝途徑，其中最為普遍的是通過甲基轉(zhuǎn)移將甜菜堿轉(zhuǎn)化為甘氨酸(導致甲基基團向甲硫氨酸循環(huán)供應).此外，一些微生物如梭菌Clostridiumsporogenes和深海微生物可以將甜菜堿還原為乙酸根和三甲基胺(Stickland反應)[30].而有些微生物甚至可以利用甜菜堿作為唯一的碳源和氮源使用[31].

3.1 甜菜堿在甲基代謝中的作用

微生物中存在甲硫氨酸循環(huán)，該循環(huán)最終能夠?qū)⒓谆鶑募琢虬彼徂D(zhuǎn)移到甲基受體.如圖1所示，甲硫氨酸首先轉(zhuǎn)化為甲基供體S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，然后再將甲基轉(zhuǎn)移至甲基受體.甲基轉(zhuǎn)移后，SAM降解為S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)，隨后降解為高半胱氨酸(HC).HC則可以與甜菜堿反應重新形成甲硫氨酸.該反應以甜菜堿高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(BHMT)作為催化劑，將甜菜堿中的甲基轉(zhuǎn)移到HC形成甲硫氨酸，甜菜堿脫甲基后形成二甲基甘氨酸.BHMT依賴的甜菜堿分解代謝在自然界中廣泛存在，在細胞甲基代謝中發(fā)揮重要作用.

BHMT作為甜菜堿分解代謝的關(guān)鍵酶已被廣泛研究，其中來源于哺乳動物的BHMT為扭曲桶狀的鋅結(jié)合酶[32]，盡管在微生物中已經(jīng)證明存在BHMT，但是其編碼基因很少能夠被鑒定出來，這可能是由于哺乳動物BHMT和微生物BHMT之間的相似度極低.只有一種來自中華根瘤菌的BHMT基因與來源于哺乳動物BHMT基因具有較高的相似度[33],而其他微生物來源的BHMT基因，例如農(nóng)桿菌Agrobacteriumtumafaciens和綠膿假單胞菌Pseudomonasaeruginosa，與哺乳動物來源的BHMT基因相比沒有同源性[31].據(jù)報道，在脫硫桿菌中存在一種不同類型的甜菜堿甲基轉(zhuǎn)移酶(三甲胺甲基轉(zhuǎn)移酶家族)，可以通過四氫葉酸(THF)中間體將甲基氧化成二氧化碳，同時將甜菜堿脫甲基化形成二甲基甘氨酸[34].此外，甜菜堿代謝與氨基酸代謝和中心代謝有關(guān).二甲基甘氨酸可以進一步分解成肌氨酸和甘氨酸，甘氨酸可進一步代謝產(chǎn)生丙酮酸產(chǎn)物[35].因此，某些需氧菌，如假單胞菌，可以通過甜菜堿來合成許多細胞組分[31].

3.2 其他分解代謝途徑

有些微生物演化出特殊的甜菜堿分解代謝途徑.例如，膽堿氧化為甜菜堿原本是不可逆的催化反應，然而，對青霉Penicilliumfellutanu和構(gòu)巢曲霉Aspergillusnidulans的代謝研究表明甜菜堿可以轉(zhuǎn)化為甜菜堿醛并進一步被還原成膽堿[36-37].這種從甜菜堿到膽堿的特殊還原途徑進一步揭示出膽堿在真菌中的基本功能，但甜菜堿在該途徑中的生物化學和分子代謝過程仍有待闡明.

甜菜堿也可以被分解為其他功能性營養(yǎng)物質(zhì).例如，通過Stickland反應，甜菜堿可以在甜菜堿還原酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜猁}和三甲胺.三甲胺是某些微生物生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，如Methanosarcina屬的菌株.最近的一項研究結(jié)果表明，協(xié)作性的原核生物群體能夠利用甜菜堿分解形成的功能性營養(yǎng)物質(zhì)適應最惡劣的環(huán)境[30].

4 甜菜堿在微生物發(fā)酵中的應用

甜菜堿已經(jīng)成功應用于應用微生物學和生物技術(shù)領域.甜菜堿主要用作應激保護劑或細胞內(nèi)酶的穩(wěn)定劑以抵抗脅迫條件.同時，甜菜堿也被用來作為甲基化反應的甲基供體.在大多數(shù)情況下，培養(yǎng)基中甜菜堿的補充不會顯著提高生產(chǎn)成本或改變發(fā)酵過程.甜菜堿可以從豐富的自然資源中獲得，價格約為1 200 美元/噸.考慮到其添加量低(約1～2 g/L)，單位成本相當?shù)停瑹o需復雜的預處理就可以直接添加到培養(yǎng)基中.然而，甜菜堿目前僅應用于少數(shù)的微生物反應過程，如表2所示.隨著對微生物中甜菜堿功能和甜菜堿代謝的進一步了解，預計其在微生物發(fā)酵工業(yè)中的應用將會擴大.

表2 甜菜堿在微生物發(fā)酵中的應用Table 2 Application of betaine in microbial fermentation

4.1 細胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)

作為最普遍的滲透劑之一，甜菜堿可以提高微生物細胞的滲透耐受性，因為它可以在細胞內(nèi)高濃度積累(通過運輸或生物合成)，從而平衡細胞內(nèi)外的滲透壓力.甜菜堿可以增加脫水和補液期間微生物細胞的存活率，在早期應用甜菜堿時，利用該性質(zhì)來保護儲藏和活化過程中的工業(yè)微生物菌株.另一個有效策略是在發(fā)酵培養(yǎng)基中補充甜菜堿.如已報道的在乳酸鹽、乙醇、賴氨酸和丙酮酸鹽的發(fā)酵中添加甜菜堿，可以增加細胞生長速率，并且可以改善高滲脅迫條件(高濃度碳水化合物底物或產(chǎn)物)下菌株的發(fā)酵性能(表2).

4.2 酶保護劑

甜菜堿不僅可以保護整個細胞，還可以保護各種細胞內(nèi)成分免受環(huán)境壓力，包括應激敏感的蛋白質(zhì)和酶.例如，甜菜堿對天然蛋白質(zhì)提供熱保護，并有益于大腸桿菌細胞中應激誘導的蛋白質(zhì)聚集體的恢復[44].另一項研究發(fā)現(xiàn)甜菜堿可以克服脫水或滲透脅迫下蛋白質(zhì)擁擠的不穩(wěn)定作用[45].此外，微生物發(fā)酵中添加甜菜堿是有效的，因為發(fā)酵過程存在滲透脅迫，而代謝關(guān)鍵酶對滲透脅迫是敏感的.甜菜堿可以增加乳酸、賴氨酸和支鏈淀粉酶發(fā)酵中關(guān)鍵酶的活性，從而提高這些產(chǎn)品的產(chǎn)量(表2).此外，最新研究表明，甜菜堿及其類似物對各種酶如葡萄糖苷酶、堿性磷酸酶、乳糖脫氫酶、硫酸酯酶和辣根過氧化物酶都具有保護作用，這些酶在凍融之后大部分活性得到保留[46].

4.3 甲基供體

SAM依賴性和甲基轉(zhuǎn)移酶介導的甲基化反應常常發(fā)生在結(jié)構(gòu)復雜的天然化合物的生物合成中，因為它們的化學結(jié)構(gòu)中通常有一個或多個甲基.通過甲基轉(zhuǎn)移來補充相應的甲基供體可以提高這些天然化合物的產(chǎn)量.例如，補充甜菜堿可以顯著改善硝酸假單胞菌維生素B12的工業(yè)發(fā)酵[43]，因為維生素B12在其最終結(jié)構(gòu)中含有8個甲基.與銅綠假單胞菌類似[31]，生產(chǎn)維生素B12的脫氮硝酸菌也含有有效的甜菜堿分解代謝途徑，可以從甜菜堿中除去甲基，隨后將甲基用于甲硫氨酸，SAM和維生素B12的合成中.在維生素B12的生產(chǎn)中，甜菜堿不斷流加到培養(yǎng)基中用于分解代謝，其添加量約為甜菜堿用于細胞滲透調(diào)節(jié)或酶保護劑時的10倍.這種添加量的差異進一步證明甜菜堿在維生素B12生產(chǎn)中可作為甲基供體.然而，這種應用在微生物中并不多見，因為只有很少的微生物具有甜菜堿的天然分解代謝途徑.

5 結(jié) 論

甜菜堿由于具有優(yōu)良的生物相容性、合理的碳氮比和高豐富度而成為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、甲基供體以及微生物的直接營養(yǎng)物質(zhì).在這篇綜述中，總結(jié)了微生物中甜菜堿代謝的途徑、轉(zhuǎn)運蛋白和關(guān)鍵酶，為甜菜堿的研究提供了最新的概述.隨著甜菜堿分解代謝途徑的不斷剖析，其可以被設計到已知的微生物工程菌株中來增強甲基代謝，使微生物能夠更加高效的生產(chǎn)某些結(jié)構(gòu)復雜的次級代謝產(chǎn)物.甜菜堿獨特的生物相容性及生理活性將使其在生物技術(shù)領域具有廣闊的應用前景.