離子色譜法測定水果中的有機酸

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(杭州市余杭區(qū)食品藥品監(jiān)測中心，浙江 杭州 311100)

水果富含水分、糖分、纖維素、維生素和有機酸等，是公認的健康食品.其中的各種有機酸不僅對水果的風味和營養(yǎng)有著重要影響，而且部分有機酸還有著特殊的功效，如抗氧化、防腐和抑菌等[1].有機酸是三羧酸循環(huán)中的一個重要生化特征，水果采摘后，其新陳代謝過程依然在繼續(xù)，并且不斷變化，因此，有機酸也是水果質量的動態(tài)判斷指標[2].檢測有機酸的方法有很多，但各有局限.例如滴定法只適合測定總酸[3]；酶學法適合測定某種特定有機酸[4]；光譜法通常要進行預衍生化、預分離等前處理，過程麻煩且能同時分離的有機酸種類少[5]；由于有機酸沸點高，不易汽化，因此氣相色譜法準確度欠佳等[6].

高效液相色譜中的離子交換色譜法對有機酸的測定比較有優(yōu)勢，準確、快速、靈敏并能同時分離和測定多種離子[7].宋衛(wèi)得等利用梯度淋洗離子色譜法測定了白酒中26種有機酸和陰離子[8]，呂洪風利用離子色譜保留模型同時檢驗果汁中7種有機酸，對3種不同的蘋果汁進行分析,驗證了該方法的精準性和適用性[9]，研究選擇西瓜、菠蘿和枇杷3種水果，應用離子交換色譜法測定水果中的有機酸的變化規(guī)律，為水果質量的鑒別提供依據(jù).

1 實驗儀器材料和方法

1.1 原材料

西瓜、菠蘿、枇杷，購于杭州勾莊水果市場.

1.2 有機酸標準樣品(均為優(yōu)級純)

乳酸[L(+)Lactic acid]，SUPELCO，99%；草酸[Oxalic acid (Ethanedioic acid) ]，Dr.Ehrenstorfer GmbH，99.5%；蘋果酸(DL-Malic acid)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，99.5%；檸檬酸(Citric acid monohydrate)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，99.5%；酒石酸(DL-Tartaric acid)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，99.5%.

1.3 實驗儀器

ICS3000離子色譜儀，美國戴安公司；Y型精密電子天平，美國雙杰兄弟有限公司；PHILIPS打漿機，廣州市奇明經濟發(fā)展有限公司；TGL-16M高速立式冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；HYJD超純水器，杭州永潔達凈化科技有限公司；水相針式濾器(聚醚砜)，0.22 μm，上海安譜科學儀器有限公司；一次性使用1 mL注射器(帶針)，上?？祲坩t(yī)療器械有限公司；1 000，200 μL移液槍，上海艾測電子科技有限公司.

1.4 試驗方法

1.4.1 實驗材料的選擇

選擇成熟度相仿、大小相近、顆粒完整的枇杷，常溫條件陰涼處保存，每隔12 h取樣一次，每次取樣以5個為一組，從外觀上挑選成熟度接近的原料，每次取樣時都去除果皮，盡可能選擇果實的相同部位.

選擇體積較大的西瓜、菠蘿各一個，選取一圓周，取樣部位都在靠近果皮的一側，每隔一天取樣一次，取樣后取樣部位用保鮮膜包裹，在常溫下保存，取樣和保存都在超凈臺上完成.

1.4.2 樣品前處理

每隔1 d，分別準確稱取10 g左右西瓜、菠蘿、枇杷果肉.加90 mL去離子水，研磨，之后在4 ℃，13 000 r/min條件下，離心20 min，取上清液即為提取液.用移液槍移取提取液300 μL、去離子水1 200 μL于試劑瓶中，得到稀釋50倍的樣品溶液，再用0.22 μm的濾膜過濾后供離子色譜進樣測試.

1.4.3 標準液的配制

用電子天平分別稱取檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、草酸、乳酸0.050 g，定容至50 mL容量瓶中，配制成1 000 mg/L的標準儲備液.分別用移液槍準確移取檸檬酸液500 μL、蘋果酸液500 μL、酒石酸液500 μL、乳酸液500 μL和草酸液500 μL，并入100 mL容量瓶中，然后用超純水定容至刻度，從而得到檸檬酸質量濃度為5 mg/L、蘋果酸質量濃度為5 mg/L、酒石酸質量濃度為5 mg/L、乳酸質量濃度為5 mg/L和草酸質量濃度為5 mg/L的混合標準液.

1.4.4 色譜條件

抑制器膜：ASRS_4 mm；色譜柱：IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm；保護柱：IonPac AS11-HC 4 mm×50 mm；流動相：KOH (淋洗液自動發(fā)生器產生)，進行梯度測試，流速為1.0 mL/min；抑制電流為150 mA；柱溫30 ℃；進樣量為50 μL.

2 結果與分析

2.1 色譜柱的選擇

對比IonPac AS11 4 mm×250 mm和IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm兩種色譜柱的分離效果，可以發(fā)現(xiàn)兩者的離子交換功能基均為帶季銨鹽功能基的陰離子交換樹脂，對OH-的選擇性強，親水性較強.但是，IonPac AS11 4 mm×250 mm的柱容量很小，僅有45 μmol/柱；而IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm柱的柱容量較高，達到了270 μmol/柱，柱容量越大越有利于對乳酸、乙酸等一價有機酸的保留，色譜出峰時峰形越好，更有利于實現(xiàn)樣品中多組分的同時分離.另外一方面，通過實驗對比對弱組分的保留情況看，IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm柱對目標化合物的分離效果好于IonPac AS11 4 mm×250 mm.所以本實驗選用IonPacAS11-HC 4 mm×250 mm色譜柱.

2.2 流動相與梯度的優(yōu)化

離子交換色譜法分析有機酸常用稀堿溶液作淋洗液.因OH-為親水性離子，對固定相中的水合區(qū)有著天然的親水性，從而能夠有效地置換其他陰離子.常用氫氧化鈉或氫氧化鉀作淋洗液，因為K+的當量電導較低，所以本實驗采用KOH作淋洗液.由淋洗液自動發(fā)生器產生，保證了其高純度，避免雜質的污染，濃度準確，流速穩(wěn)定，平衡時間短，降低基線漂移，出峰平直、穩(wěn)定.

實驗采用梯度洗脫技術，在分離過程中連續(xù)改變流動相中的KOH濃度.分別采用0.6,0.8,1.2,1.6,2.0,10,20,30 mmol/L KOH淋洗液淋洗，發(fā)現(xiàn)淋洗液濃度為30 mmol/L時，檸檬酸較易洗脫，淋洗液濃度為0.8 mmol/L時，乳酸、草酸、酒石酸、蘋果酸能較易洗脫，得到尖銳峰形.經過多次試驗確定淋洗液KOH濃度梯度程序如表2所示.

在該淋洗條件下，5種有機酸可實現(xiàn)基線分離，分離效果如圖1所示.

表1 離子色譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of ion chromatography

圖1 5種有機酸混合標準溶液色譜圖Fig.1 The chromatogram of 5 kinds of mixed organic acid standard solution

分別調節(jié)流速為0.6,0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL/min，當流速增大時，分析時間明顯縮短，但當流速大于1.0 mL/min時，5種有機酸有機酸會與其中其他的雜質峰所重疊，不利于出峰的形狀，當流速小于1.0 mL/min時，5種有機酸的出峰時間延長，但對5種有機酸的分離度影響并不大.因此，本實驗選用1.0 mL/min的淋洗液流速.

2.3 方法的線性范圍及檢出限

根據(jù)混合標準液出峰值的大小，分別取5種有機酸儲備液100 μL，稀釋定容于100 mL容量瓶中，配制成混合標準液.以質量濃度(mg/L)為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y，進行線性回歸.同時，按3倍信噪比計算得出檢出限，5種有機酸的線性方程列于表2.對菠蘿進行加標回收實驗，取兩份樣品，一份加標，一份對照，重復測定6次，進行回收率實驗.

由表2可知：該方法所得出的指標中，選擇的離子色譜檢測體系對有機酸的檢測顯示了較高的靈敏度，檢出限較低，精密度好，被測組分的峰面積與進樣質量濃度呈良好的線性關系，且線性范圍寬，滿足所測3種水果中有機酸含量的變化特征的檢測要求.5種有機酸的加標回收率為95%～100%，相對標準偏差RSD(n=6)均小于3.0%，該方法具有較好的穩(wěn)定性和回收率.

表2 5種有機酸的線性范圍、檢出限和回收率Table 2 Linear range,detection limit and recovery rate of 5 kinds of organic acids

2.4 樣品中的有機酸

按照實驗優(yōu)化的色譜條件，將處理好的樣品在梯度淋洗離子色譜中得到以下色譜圖，菠蘿樣品見圖2.

圖2 菠蘿樣品中有機酸的離子色譜圖Fig.2 Ionic chromatograms of organic acids in pineapple

圖中常見的5種有機酸分離效果良好，圖2為菠蘿樣品的有機酸色譜圖.圖譜中共有10個峰，可以定性得出，菠蘿中的有機酸含有蘋果酸、檸檬酸、草酸、乳酸和酒石酸，圖譜中還有5個峰沒有定性，除了第2個未知峰之外，其他峰含量很小，分析可以得出菠蘿中主要有機酸為檸檬酸和蘋果酸，分別占總酸的67%，26%左右.

由色譜圖的峰面積自動計算得到菠蘿里5種有機酸含量，見表3.

表3 菠蘿樣品中有機酸的質量分數(shù)Table 3 The content of organic acids in pineapple

圖3為枇杷樣品中有機酸的離子色譜圖.

圖3 枇杷樣品中有機酸的離子色譜圖Fig.3 Ionic chromatograms of organic acids in loquat

圖譜中共有9個峰，可以定性得出，枇杷中的有機酸含有乳酸、草酸、檸檬酸、酒石酸和蘋果酸，其中最主要的是蘋果酸，其含量遠遠高于其他有機酸，占總酸的94%左右，其次為酒石酸和草酸.

由色譜圖的峰面積自動計算得到枇杷里5種有機酸含量，見表4.

表4 枇杷樣品中有機酸的質量分數(shù)Table 4 The content of organic acids in loquat

圖4為西瓜樣品中有機酸的離子色譜圖.

圖譜中共有8個峰，可以定性得出，西瓜果實中含有的有機酸為乳酸、草酸、檸檬酸、酒石酸和蘋果酸，其中最主要的是蘋果酸，其含量約占總酸的78.7%，其次是檸檬酸和酒石酸.

由色譜圖的峰面積自動計算得到枇杷里5種有機酸含量，見表5.

圖4 西瓜樣品中有機酸的離子色譜圖Fig.4 Ionic chromatograms of organic acids in watermelon

表5 西瓜樣品中有機酸的質量分數(shù)Table 5 The content of organic acids in watermelon

2.5 水果貯藏過程中有機酸的代謝

有機酸是水果的一個標志性特征成分，因采摘后的水果依然有新陳代謝，所以在水果儲藏期間有機酸含量是動態(tài)變化的.而且不同水果變化狀況有所區(qū)別的，以下是儲存5 d的水果有機酸變化情況.

2.5.1 菠 蘿

在保證其他條件一致的前提下，將每天一次采集到的樣品進行離子色譜測定，得到相應時間段的結果見表6.

表6 菠蘿果實貯藏期間有機酸質量分數(shù)的變化情況Table 6 Thecontentoforganic acids in pineapple during storage

由表6可以可知：從含量上看檸檬酸和蘋果酸是菠蘿儲存代謝中的主要有機酸，其次為草酸和乳酸，酒石酸的含量最少.在5 d的儲藏期內，檸檬酸、蘋果酸和總酸都是呈現(xiàn)上升的趨勢，尤其是第5天相比第1天，總酸量高出近一倍，所以菠蘿儲存時間越長酸澀味越強甜度越低也就顯而易見了.草酸、乳酸和酒石酸在5 d的時間內，相對來說變化不是很大，對菠蘿口感影響較小.雖然也有其他相關資料報道菠蘿在貯藏過程中檸檬酸和總酸的含量都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但是與本實驗并不矛盾，因本實驗儲存時間短，只有5 d.之所以這樣考慮，是因為作為水果食品，新鮮度十分重要，如果儲存過長時間，就會導致水果的腐爛變味甚至無法食用.

2.5.2 枇 杷

與菠蘿相比枇杷更易腐爛，所以在48 h之內完成5次采樣，離子色譜測定結果見表7.

表7 枇杷果實貯藏期間有機酸質量分數(shù)的變化Table 7 The content of organic acids in loquat during storage

由表7可以看出：枇杷中蘋果酸最多，占總酸94%左右，檸檬酸、草酸、乳酸和酒石酸含量較少.在前36 h蘋果酸和總酸含量呈上升趨勢，48 h的數(shù)據(jù)顯示檸檬酸、蘋果酸和總酸含量都在下降，草酸、乳酸和酒石酸略微上升的.這也解釋了為什么枇杷采摘后隨著儲存時間的延長越來越淡而無味.另外隨著枇杷果實的衰老與腐爛的開始，酸的下降速度加劇，所以如果常溫保存，一般在36 h內最好食用完，否則品質會急劇下降.

2.5.3 西 瓜

可能因為西瓜中有機酸含量少，測定難度稍大，關于西瓜中有機酸含量的測定鮮有報道，未見用離子色譜法測定西瓜中的有機酸，本實驗對此作了探索.西瓜采樣方法與菠蘿相同，表8是離子色譜法測定的結果.

表8 西瓜果實貯藏期間有機酸質量分數(shù)的變化Table 8 The content of organic acids in watermelon during storage

由表8可以看出：西瓜中蘋果酸和檸檬酸最多，分別占總酸的73%左右和20%左右，而草酸、乳酸和酒石酸較少.在前3天蘋果酸、檸檬酸和總酸含量呈現(xiàn)上升趨勢，第4天數(shù)據(jù)顯示檸檬酸和總酸在下降，蘋果酸和乳酸卻有上升.可能西瓜在前3天單純處于果實后熟階段，之后品質開始下降，并伴隨著檸檬酸的大量消耗.可見，新鮮西瓜在常溫下放置的時間也不宜過長，一般放置2 d左右西瓜風味較好.

3 結 論

實驗建立了離子交換色譜法測定菠蘿、枇杷、西瓜中5種有機酸含量的方法.3種水果中含有多種有機酸，但經過實驗中樣品處理、色譜柱的選擇、梯度淋洗等方法，使得常見有機酸的極性和離解的難易程度與所測定的5種有機酸差異很大，所以對5種有機酸的測定基本沒有影響.實驗證明，選用IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm色譜柱，分別在0.8，30 mmol/L KOH淋洗液條件下以1.0 mL/min的流速進行離子色譜法測定5種有機酸的方法，樣品前處理簡單，操作方法簡便、快捷，線性范圍寬，分析結果可靠，應用范圍廣.3種果實采摘后，其中的有機酸的積累仍然沒有停止，在貯藏過程中，枇杷和西瓜果實中的有機酸含量都是先增加后降低，主要是檸檬酸的代謝而消耗，菠蘿果實中的有機酸含量一直在遞增，說明菠蘿果實的取樣時間太短，菠蘿果實還處于后熟的過程，有機酸的代謝速度慢.3種水果果實中的有機酸含量分別為菠蘿>枇杷>西瓜，說明菠蘿的風味主要由有機酸組成，而西瓜的風味則主要由果實中的糖類構成，3種果實的貯存時間長短分別為菠蘿>西瓜>枇杷.