張 悅 ， 季 靜 *， 關(guān)春峰 ， 金 超 ，李 倩 ， 閆 豹 ， 王 罡*， 王昱蓉

（1. 天津大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300072；2. 天津市天大天福生物技術(shù)有限公司，天津 300384）

我國(guó)是以農(nóng)業(yè)為第一產(chǎn)業(yè)的大國(guó)，生物質(zhì)能源每年有一半為秸稈資源，可見我國(guó)擁有相當(dāng)龐大的秸稈資源保有量，但因?yàn)榻到饧夹g(shù)不發(fā)達(dá)、工業(yè)化難度較大、資源利用成本高，使秸稈綜合利用率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[1]。在秸稈的構(gòu)成中，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素互相聯(lián)結(jié)呈現(xiàn)出復(fù)雜且不連續(xù)的層狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)使得秸稈降解的難度加大，進(jìn)而降低了秸稈的開發(fā)與利用率[2]。目前研究與利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵的科研機(jī)構(gòu)都圍繞著以下關(guān)鍵工藝進(jìn)行：一是預(yù)處理工藝，即通過不同物理、化學(xué)或生物等方法，使纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)被破壞，從而易于被降解；二是水解工藝，即通過酸法或酶法把纖維素和半纖維素水解成五碳糖和六碳糖；三是發(fā)酵工藝，選用特殊的菌種共同培養(yǎng)，對(duì)上述的五碳糖和六碳糖進(jìn)行發(fā)酵[3]。但單一的處理方法存在著成本高、耗時(shí)長(zhǎng)或降解效率低等問題。結(jié)合秸稈資源開發(fā)優(yōu)勢(shì)大及降解難的現(xiàn)狀，可見秸稈資源的高效利用需進(jìn)行多種工藝結(jié)合研究。

利用某些微生物可以高效降解秸稈纖維素類和木質(zhì)素類物質(zhì)的功能，大大提高秸稈的降解率。真菌是目前研究深入、應(yīng)用廣泛的降解菌種之一。其不僅能夠分泌胞外酶，而菌絲對(duì)木質(zhì)素的醋質(zhì)層也有較強(qiáng)的機(jī)械穿透作用，大量研究表明，白腐菌對(duì)木質(zhì)素的降解最為徹底，但是由于白腐菌產(chǎn)酶存在培養(yǎng)條件控制困難、酶活力較低、發(fā)酵周期長(zhǎng)、生產(chǎn)成本高等問題，很難在短時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)出大量且均一的培養(yǎng)液。而木霉、青霉、曲霉等的菌種對(duì)胞外纖維素酶的分泌能力較強(qiáng)且適合大規(guī)模的固體或液體培養(yǎng)，所以在生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用，目前已成為市場(chǎng)內(nèi)應(yīng)用前景最佳的纖維素酶工業(yè)[4]。且研究表明復(fù)合霉菌降解秸稈與單一菌株相比失重率提高了 21.3%～59.6%[5]。而在化學(xué)方法降解秸稈的研究中，李軼[6]、杭志喜等[7]則分別研究了稀酸和堿對(duì)秸稈的降解并得到了明顯效果，降解率最高可達(dá)39.28%。

綜上所述，對(duì)秸稈進(jìn)行降解的方法與工藝有很多，但單一的降解方法問題多、困難大，利用生物與化學(xué)途徑結(jié)合則可有效縮短降解時(shí)間、提高降解速率。而另一方面，因?yàn)槲⑸锞士娠@著改善農(nóng)田土壤生態(tài)微環(huán)境、土壤理化性質(zhì)及植物營(yíng)養(yǎng)狀況，可有效提高植物抗逆性，增加作物產(chǎn)量，目前已在農(nóng)作物市場(chǎng)中得到廣泛應(yīng)用[8]。故本實(shí)驗(yàn)從菌肥中篩選出兩株纖維素酶高產(chǎn)霉菌，欲利用此霉菌對(duì)化學(xué)法預(yù)處理工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過秸稈干粉失重率探究不同預(yù)處理對(duì)兩株木霉降解玉米秸稈效果的影響，為農(nóng)作物秸稈的高效利用提供一些理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用預(yù)處理原材料為秸稈粉末，來自田間玉米秸稈研磨制成，約存放半年，秸稈中約含15%～17%水分，其余成分主要為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等有機(jī)物及少量灰分；預(yù)處理試劑為冰乙酸、氫氧化鈉溶液；微生物菌肥為黑曲霉菌肥、哈茨木霉菌肥和綠色木霉菌肥。1.1.1培養(yǎng)基

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）固體培養(yǎng)基：CMC-Na 15 g；NH4NO31 g；KH2PO41 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；蛋白胨1 g；瓊脂 20 g；蒸餾水1 000 mL；pH 7.0，121℃滅菌20 min。

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）液體培養(yǎng)基：CMC-Na 15 g；NH4NO31 g；KH2PO41 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；蛋白胨1 g；蒸餾水1 000 mL；pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.1.2 主要試驗(yàn)試劑

1）0.05mol/L pH 5.0檸檬酸緩沖液

A液（濃度為0.1 mol/L 的檸檬酸溶液）：準(zhǔn)確的稱量檸檬酸樣品21 g，溶解于蒸餾水后，移入 1 000 mL容量瓶準(zhǔn)確定容并搖勻，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

B液（濃度為0.1 mol/L 的檸檬酸鈉溶液）：準(zhǔn)確的稱量檸檬酸鈉樣品29 g，溶解于蒸餾水后，搖勻并定容于1 000 mL容量瓶，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

分別量取A液205 mL以及B液295 mL，混勻后定容于1 000 mL容量瓶中，即為配制好的0.05 mol/L，pH 5.0的檸檬酸緩沖液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2）濃度為0.51%的CMC-Na標(biāo)準(zhǔn)溶液

稱量CMC-Na樣品0.51 g溶于少量檸檬酸緩沖液中，水浴鍋50℃～70℃加熱至完全溶解，再用檸檬酸緩沖液準(zhǔn)準(zhǔn)確容至100 mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3）DNS試劑

準(zhǔn)確的稱量0.5 g 3,5-二硝基水楊酸，再加入20 mL 濃度為2 mol/L的NaOH溶液和50 mL蒸餾水充分?jǐn)嚢柚镣耆芙夂蠹尤?0 g酒石酸鈉，待其冷卻后定容于100 mL容量瓶中，最終移入棕色試劑瓶中室溫放置7 d，待其穩(wěn)定后備用。

4）濃度為1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液

于105 ℃干燥葡萄糖至衡重，準(zhǔn)確稱取0.1 g，用少量蒸餾水溶解后，移入100 mL容量瓶中準(zhǔn)確定容并充分搖勻，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本研究采用微生物菌種的復(fù)合體系構(gòu)建與化學(xué)預(yù)處理結(jié)合的方法，通過測(cè)定降解前后玉米秸稈的失重率，探討不同預(yù)處理對(duì)兩株木霉降解玉米秸稈效果的影響。

1.2.1 秸稈粉碎

研磨玉米秸稈將其粉碎為粉末，后121℃高壓滅菌30 min，取出后60℃烘箱烘干，完成第一步玉米秸稈粉末的制備。

1.2.2 秸稈化學(xué)試劑預(yù)處理

每錐形瓶分別加入1 g粉碎秸稈，每錐形瓶分別加入不同比例化學(xué)試劑，加入量如表1所示，充分搖勻室溫培養(yǎng)7 d。

表1 化學(xué)試劑比例

1.2.3 纖維素降解菌的初篩

將不同組合培養(yǎng)獲得的單菌落培養(yǎng)皿用剛果紅進(jìn)行染色，此步驟用于對(duì)不同菌種對(duì)纖維素降解的能力進(jìn)行初步篩選。首先利用1 mg/mL的剛果紅染色液對(duì)待測(cè)培養(yǎng)基進(jìn)行30 min染色，染色結(jié)束后棄去染液，再利用1 mol/L的NaCl溶液對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行30 min脫色，脫色結(jié)束后棄去廢液，觀察培養(yǎng)基內(nèi)是否有以菌落為中心的透明圈產(chǎn)生，并根據(jù)每個(gè)培養(yǎng)皿透明圈的清晰程度以及透明圈直徑和菌落直徑比值的大小可以初步判斷不同菌系對(duì)纖維素的降解能力。

1.2.4 降解纖維素復(fù)合菌系的構(gòu)建

將初篩獲得的菌種接種于CMC-Na液體培養(yǎng)基中，120 r/min條件下30℃振蕩培養(yǎng)，后取培養(yǎng)液進(jìn)行CMC及FPA酶活力的測(cè)定，所測(cè)酶活力大小可作為復(fù)篩的判斷依據(jù)。

粗酶液的制備方法：將待測(cè)培養(yǎng)液6 000 r/min離心10 min，取離心后上清液即為備用粗酶液。

酶活力的定義：取1 mL得酶液在1 min規(guī)定時(shí)間內(nèi)水解底物所生成的1 μmol的還原糖量即為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

酶活力大小的計(jì)算方式：測(cè)定的酶活力大小根據(jù)公式（1）進(jìn)行計(jì)算。

式中，X為待測(cè)定的酶活力大?。║/mL），S為還原糖的含量（mg），V1為稀釋后粗酶液的定容體積（mL），V2為反應(yīng)加入待測(cè)酶液的體積（mL），V為待測(cè)粗酶液的體積（mL）。

1.2.4.1 酶活力的測(cè)定方法（本實(shí)驗(yàn)采用還原糖法）

1）CMC酶活力的測(cè)定方法

準(zhǔn)備4支干燥清潔的25 mL試管，1支為空白對(duì)照管，剩余3支為待測(cè)管，首先于各試管中分別加入1.5 mL CMC-Na標(biāo)準(zhǔn)溶液，再放置50℃水浴鍋中進(jìn)行5 min預(yù)熱，同時(shí)將適當(dāng)稀釋后的粗酶液進(jìn)行預(yù)熱，并向各待測(cè)管中加入0.5 mL粗酶液，充分混勻后將其與空白管同時(shí)進(jìn)行30 min的50℃水浴反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取0.5 mL適當(dāng)稀釋的粗酶液于空白管中，并向空白管和待測(cè)管內(nèi)同時(shí)加入3 mL DNS試劑，沸水浴中反應(yīng)5 min，反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻，并用蒸餾水準(zhǔn)確定容至25 mL。在540 nm波長(zhǎng)下，以空白對(duì)照管調(diào)零，測(cè)定待測(cè)管溶液在該波長(zhǎng)下的吸光度大小，后根據(jù)所繪葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線確定待測(cè)液中還原糖的含量，并準(zhǔn)確計(jì)算出CMC酶活力的大小。

2）FPA酶活力的測(cè)定

取4支干燥清潔的25 mL試管，1支為空白對(duì)照管，其余3支為待測(cè)管，首先分別稱取0.5 g濾紙條加入所有試管中，后于 50℃水浴鍋預(yù)熱 5 min，于此同時(shí)適當(dāng)預(yù)熱稀釋后的粗酶液，并向各待測(cè)管中加入0.5 mL粗酶液，充分混勻后將其與空白管同時(shí)進(jìn)行30 min的50℃水浴反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取0.5 mL適當(dāng)稀釋的粗酶液于空白管中，并向空白管和待測(cè)管內(nèi)同時(shí)加入3 mL DNS試劑，沸水浴中反應(yīng)5 min，反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻，并用蒸餾水準(zhǔn)確定容于25 mL試管中。將波長(zhǎng)調(diào)至540 nm，通過空白對(duì)照管進(jìn)行調(diào)零，測(cè)定待測(cè)管溶液在該波長(zhǎng)下的吸光度，后根據(jù)所繪葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線確定待測(cè)液中還原糖的含量，并準(zhǔn)確計(jì)算出FPA酶活力的大小。

1.2.4.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)備6支干燥清潔的25 mL試管，分別將不同含量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和不同含量的蒸餾水加入試管中，充分的振蕩混勻后再加入3 mL DNS溶液，搖勻后沸水浴反應(yīng)5 min，沸水浴反應(yīng)結(jié)束后將其迅速冷卻，并利用蒸餾水定容至25 mL試管中，后測(cè)定每管在540 nm波長(zhǎng)下的吸光度大小。以葡萄糖的含量作為橫坐標(biāo)，溶液的吸光度大小作為縱坐標(biāo)，準(zhǔn)確的繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 復(fù)合菌系與化學(xué)試劑組合

調(diào)節(jié)各組合預(yù)處理液pH值于4.5～5.5之間，按5%接種比例向各錐形瓶中接入經(jīng)過篩選后纖維素酶產(chǎn)能力最強(qiáng)的復(fù)合菌系，28℃震蕩培養(yǎng)7天。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將各實(shí)驗(yàn)組高溫滅菌，將剩余物質(zhì)用無菌水進(jìn)行充分洗滌后烘干至恒重，將剩余干物質(zhì)質(zhì)量記為M1（g），試驗(yàn)前秸稈質(zhì)量記為M0（g），秸稈的失重率（D）利用下述公式（2）進(jìn)行計(jì)算。

式中，D為待測(cè)定的失重率，M0為發(fā)酵前的秸稈質(zhì)量，M1為發(fā)酵后剩余干物質(zhì)的質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素降解菌的初篩

經(jīng)剛果紅染色后所有的CMC-Na培養(yǎng)基均獲得了不同大小的透明圈，各組透明圈對(duì)比如圖1所示，透明圈直徑與菌落直徑比值的結(jié)果比較如圖2所示。

圖1 透明圈對(duì)比圖

表2 透明圈直徑與菌落直徑比值大小

圖2 不同菌系透明圈直徑與菌落直徑對(duì)比圖

圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

由于剛果紅染液可以與纖維素類物質(zhì)相互結(jié)合，所以經(jīng)剛果紅染色后的復(fù)合物會(huì)呈現(xiàn)出紅色。但如果培養(yǎng)基中纖維素類物質(zhì)已經(jīng)被分解，剛果紅則因無可結(jié)合受體而在脫色中被洗滌掉，導(dǎo)致培養(yǎng)基中呈現(xiàn)出以菌落為中心的透明圈，葉姜瑜等人認(rèn)為能夠利用透明圈的是否產(chǎn)生作為微生物菌落是否具有產(chǎn)生纖維素酶能力的判斷依據(jù)[9]。高榕等人又進(jìn)一步的提出，可以利用透明圈直徑和菌落直徑的比值大小來判斷菌種降解纖維素能力的大小，這種方法也適合于實(shí)踐應(yīng)用中。而后來大量的研究結(jié)果也證實(shí)了其所具備的可參考價(jià)值，并且應(yīng)用于圖2不同菌系透明圈直徑與菌落直徑對(duì)比圖的實(shí)際操作中[10]。根據(jù)表2中的測(cè)量結(jié)果對(duì)比可以初步判斷不同菌系產(chǎn)纖維素酶活力的大小為：④＞⑥＞①≈②＞⑤≈⑦＞③。

2.2 纖維素降解菌的復(fù)篩

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

圖3為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

2.2.2 不同菌株的酶活力大小測(cè)定

能夠?qū)⒗w維素水解生成葡萄糖的一系列酶被統(tǒng)稱為纖維素酶，為包含多種功能相似酶的復(fù)合酶系的統(tǒng)稱。根據(jù)纖維素酶在作用過程中催化的功能和性質(zhì)差異，可基本將其分為三類：內(nèi)切β-1,4-葡聚糖苷酶或稱Cx酶即為CMC酶，外切β-1,4-葡聚糖苷酶也可稱為C1酶，以及β-葡萄糖苷酶[11]。

纖維素酶對(duì)纖維的降解機(jī)理有好多種說法，其中一種C1-Cx假說認(rèn)為，在纖維素的水解過程中CMC酶起到至關(guān)重要的作用，不僅如此，CMC酶對(duì)纖維素大分子水解生成纖維二糖和三糖的過程也有很大影響，因此其可以作為纖維素酶能力強(qiáng)弱的一個(gè)重要判斷依據(jù)[12]。

而纖維素酶在以濾紙條為底物進(jìn)行降解時(shí)所體現(xiàn)出的酶活性被稱為FPA酶活力，因?yàn)V紙中的纖維素結(jié)構(gòu)較松散的結(jié)晶度和聚合度，使其較容易被降解利用，故FPA酶活力一般可視作一個(gè)纖維素酶系的總酶活力大小判斷依據(jù)，不同酶系之間的協(xié)同作用大小既是通過FPA酶活力體現(xiàn)的。將初篩所取得的7種菌系分別接種到CMC-Na液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，測(cè)定纖維素酶活。

7種菌系酶活力大小如圖4、圖5所示。根據(jù)兩圖顯示結(jié)果可知不僅不同種菌株產(chǎn)生的同一種酶活力之間存在不同，而且同一種菌株產(chǎn)生不同酶的能力大小也存在差異。而纖維素的降解過程是在多種酶的協(xié)同參與下完成的，由于單一的菌株所產(chǎn)酶的功能和性質(zhì)都具有一定的局限性，所以不能靠單一的菌種來提供降解纖維素的全部酶系。所以為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)高效降解纖維素的目標(biāo)，需要結(jié)合不同功能比較強(qiáng)的酶協(xié)同作用。故結(jié)合圖2中透明圈直徑與菌落直徑的比值對(duì)比以及圖4、圖5中對(duì)不同菌系酶活的大小比較可得出④號(hào)酶系的綜合能力較強(qiáng)，能夠用來與化學(xué)法預(yù)處理組進(jìn)行進(jìn)一步的秸稈降解。

圖4 不同菌系CMC酶活力比較

圖5 不同菌系FPA酶活力比較

2.3 降解工藝的確定

④號(hào)jw-1和jw-2復(fù)合菌系與不同濃度酸、堿預(yù)處理組結(jié)合降解后各組的失重率如圖6、圖7所示，由兩圖可知復(fù)合菌系與10% NaOH降解效果最佳，失重率可達(dá)76.8%。故選定10% NaOH預(yù)處理結(jié)合木霉jw-1與jw-2復(fù)合菌系為降解玉米秸稈效果最優(yōu)工藝。

圖6 不同濃度NaOH預(yù)處理組失重率

圖7 不同濃度冰乙酸預(yù)處理組失重率

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，在復(fù)合菌系的構(gòu)建中，通過對(duì)透明圈與菌落直徑比值大小的對(duì)比可知，木霉jw-1與木霉jw-2產(chǎn)纖維素酶能力較高，透明圈與菌落直徑比可達(dá)到1.8，而通過CMC酶活與FPA酶活大小的比較可得出jw-1與jw-2產(chǎn)纖維素酶活力最高，CMC酶活為2.76 U/mL，F(xiàn)PA酶活為1.52 U/mL；在化學(xué)預(yù)處理與菌系結(jié)合降解工藝的篩選中，10% NaOH與 jw-1和 jw-2復(fù)合菌系結(jié)合降解效果最好，降解率可達(dá)76.8%。

與前人研究結(jié)果相比，本實(shí)驗(yàn)在化學(xué)法預(yù)處理中得出添加10% NaOH溶液對(duì)秸稈預(yù)處理降解效果最好的結(jié)論，這與李軼等[6]在試驗(yàn)中添加10% NaOH溶液后加入綠色木霉的處理方式對(duì)秸稈木質(zhì)素的降解效果較好且降解率達(dá)到39.28%的研究結(jié)果一致。本研究意在利用兩株纖維素酶高產(chǎn)菌優(yōu)化預(yù)處理工藝，并取得了可靠的分析結(jié)果。在復(fù)合菌系的構(gòu)建中，將3種纖維素酶產(chǎn)量高的菌種進(jìn)行混合篩選，并且最佳工藝降解效率達(dá)到了76.8%，與單一菌種處理相比提高了1.9倍。但對(duì)于處理原材料的選擇方面，本研究?jī)H選取玉米秸稈作為實(shí)驗(yàn)原材料，可在以后的研究中適當(dāng)增加材料的選取種類，對(duì)其他農(nóng)作物秸稈進(jìn)行有關(guān)研究，以便更好的發(fā)揮其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。