武學(xué)慶，居云悅 ，焦東亮 ，趙敏,*

1．引言

甲基苯丙胺，俗稱冰毒，屬于苯丙胺類興奮劑（Amphetamine-type stimulants, ATS），是一類成癮性的神經(jīng)興奮物質(zhì)[1-2]。這類精神活性物質(zhì)具有成癮性及嚴(yán)重的神經(jīng)毒性[3-4]，對(duì)國家、社會(huì)、家庭及個(gè)人造成嚴(yán)重的不良影響和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界面臨的新挑戰(zhàn)。因此，研發(fā)行之有效的治療方法至關(guān)重要。

rTMS是基于電磁感應(yīng)原理在大腦中形成電場(chǎng)的一種神經(jīng)刺激和神經(jīng)調(diào)節(jié)技術(shù)，其形成的磁場(chǎng)能夠無衰減地穿透顱骨進(jìn)入大腦皮層，使大腦皮層的局部電活動(dòng)發(fā)生變化，從而發(fā)揮治療效果[5]。大量研究表明，rTMS能夠治療多種嚴(yán)重的神經(jīng)精神疾病，如精神分裂、抑郁、中風(fēng)、帕金森、癲癇等，其原因可能與rTMS能夠調(diào)節(jié)大腦皮層的興奮性，改變突觸結(jié)構(gòu)及神經(jīng)元可塑性，調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放以及促進(jìn)神經(jīng)再生等有關(guān)[6-8]。

近年來，研究人員開始應(yīng)用rTMS對(duì)藥物成癮的治療作用進(jìn)行相關(guān)探索。臨床研究發(fā)現(xiàn)：rTMS可以有效減輕成癮者對(duì)海洛因、尼古丁、可卡因和酒精等的渴求程度。如Shen等人用高頻（10Hz）rTMS刺激海洛因成癮者左側(cè)DLPFC，發(fā)現(xiàn)成癮者對(duì)海洛因的渴求降低[9]；Prip fl等人同樣應(yīng)用10Hz的rTMS對(duì)尼古丁成癮者左側(cè)DLPFC進(jìn)行刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rTMS能降低患者對(duì)尼古丁的渴求[10]；Terraneo等的研究應(yīng)用rTMS（15Hz）刺激可卡因成癮者左側(cè)DLPFC，能降低患者對(duì)可卡因的渴求[11]；Mishra等應(yīng)用rTMS（10Hz）刺激酒精成癮者刺激右側(cè)DLPFC，發(fā)現(xiàn)rTMS也能減輕酒精成癮者的渴求[12]。同時(shí)動(dòng)物研究還發(fā)現(xiàn)：用rTMS（20Hz）刺激嗎啡戒斷大鼠額葉時(shí)，伏隔核腦區(qū)的多巴胺釋放水平顯著增加[13]。而Li等人應(yīng)用低頻（1Hz）rTMS刺激甲基苯丙胺成癮者DLPFC區(qū)，發(fā)現(xiàn)低頻刺激能夠增加成癮者對(duì)甲基苯丙胺的心理渴求[14]。這些研究提示高頻rTMS對(duì)藥物成癮可能具有潛在的治療作用。

目前國內(nèi)外關(guān)于rTMS治療甲基苯丙胺成癮的研究很少，rTMS對(duì)甲基苯丙胺成癮的作用尚且不明。因此本研究應(yīng)用甲基苯丙胺誘導(dǎo)的大鼠條件性位置偏愛模型，結(jié)合rTMS技術(shù)，探索高頻rTMS對(duì)甲基苯丙胺成癮的作用，為日后臨床上應(yīng)用rTMS治療甲基苯丙胺成癮提供初步的理論依據(jù)。

2．實(shí)驗(yàn)材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

我們使用雄性SD（Sprague Dawley）大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。大鼠重250 (100)g，n=70，其中，17只用于建立CPP復(fù)吸模型（Con: n=6; METH 1: n=6; METH 2: n=5），27只用于實(shí)驗(yàn)一(SAL: n=7; METH + sham:n=10; METH + rTMS: n=10)，26只用于實(shí)驗(yàn)二（SAL:n=7; METH + sham: n=9; METH + rTMS: n=10）。由中國科學(xué)院上海藥物研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)環(huán)境為恒溫（23 ± 2 ℃），濕度50%，自由進(jìn)食、進(jìn)水，12 h光暗循環(huán)。所有實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究方案》。

2.2 藥品試劑

甲基苯丙胺：中國軍事科學(xué)院提供。

2.3 建立條件性位置偏愛復(fù)吸模型

CPP實(shí)驗(yàn)器材購自上海吉量。條件位置偏愛箱為兩個(gè)大小相同的條紋箱，尺寸：40 cm*40 cm*60 cm，中間隔著一塊可移動(dòng)的板子，能使大鼠在兩箱之間自由穿梭。兩側(cè)條紋箱肉眼可辨：其中一側(cè)箱子的圖案由水平黑白相間的條紋組成；而另一側(cè)箱子是垂直黑白相間的條紋。

實(shí)驗(yàn)主要分為三大階段：大鼠條件性位置偏愛行為的形成、消退和復(fù)吸。

我們首先建立大鼠條件性位置偏愛實(shí)驗(yàn)。條件性位置偏愛實(shí)驗(yàn)主要分為四個(gè)階段：適應(yīng)期（Habituation）， 條 件 化 前 期 (Preconditioning Test)， 條 件 化 期 (Conditioning)和 測(cè) 試 期 (Postconditioning/Post-training Test)。在適應(yīng)期，封閉中間隔板，使大鼠分別適應(yīng)兩個(gè)條紋箱的環(huán)境，左右兩邊各30 min，適應(yīng)間隔6 h；條件化前期，即預(yù)跑期，中間隔板打開，使大鼠自由穿梭在兩條紋箱之間，時(shí)間為15 min，分別記錄大鼠在兩箱中的停留時(shí)間；條件化期為期四天，將大鼠分成生理鹽水對(duì)照組（Con）和CPP模型組（METH 1與METH 2），根據(jù)預(yù)跑階段記錄的時(shí)間結(jié)果，將兩側(cè)箱子分為偏愛箱與非偏愛箱，其中大鼠停留時(shí)間較長(zhǎng)的那一側(cè)為偏愛箱，另一側(cè)為非偏愛箱,并將非偏愛側(cè)箱子作為藥物配對(duì)箱。在CPP模型組，每日上午給予每只動(dòng)物腹腔注射生理鹽水（1 mg/kg），注射后立即放入偏愛箱中，用隔板封閉通道，觀察45分鐘后取出放回籠中；隔6 h后腹腔注射一次METH（1 mg/kg），注射藥物后立即放入藥物配對(duì)箱內(nèi)，用隔板封閉通道，觀察45分鐘后取出。連續(xù)訓(xùn)練4天，共注射4次METH和4次生理鹽水。生理鹽水組僅注射生理鹽水。第四階段為測(cè)試期，將實(shí)驗(yàn)鼠放入箱子內(nèi)，打開中間隔板，使大鼠在兩個(gè)箱子間自由活動(dòng)15分鐘，記錄大鼠在每個(gè)箱子的停留時(shí)間。CPP分?jǐn)?shù)是測(cè)試期在非偏愛側(cè)的停留時(shí)間減去預(yù)跑期在非偏愛側(cè)的停留時(shí)間。

成功建立起大鼠的CPP行為后，對(duì)大鼠進(jìn)行消退訓(xùn)練（Extinction）。消退方式類似條件化期，將原本注射METH的那一側(cè)，改為注射生理鹽水（1 mg/kg）并放入非偏愛箱進(jìn)行消退訓(xùn)練，連續(xù)訓(xùn)練4天后進(jìn)行消退測(cè)試（Extinction Test）。

最后，大鼠的偏愛行為消退后，采用藥物誘發(fā)的方式進(jìn)行復(fù)吸測(cè)試(Reinstatement Test)，即在測(cè)試之前對(duì)模型組大鼠腹腔注射0.5 mg/ml的甲基苯丙胺。

研究表明1mg/kg的METH能夠建立穩(wěn)定持久的CPP模型[15-16]，并且此濃度進(jìn)行條件配對(duì)的CPP模型，在CPP行為消退后可用0.5 mg/ml的甲基苯丙胺成功誘發(fā)復(fù)吸行為[17-18]。

2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了探索急慢性rTMS對(duì)METH誘導(dǎo)的條件性位置偏愛復(fù)吸行為的影響，我們?cè)O(shè)計(jì)了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)：

實(shí)驗(yàn)一：探索急性高頻（10Hz）rTMS對(duì)大鼠CPP復(fù)吸的影響。將大鼠隨機(jī)分成三組：(1) SAL組：生理鹽水對(duì)照組；(2) METH + sham組（偽刺激組），CPP行為發(fā)生消退后，給予大鼠為期1天的偽刺激處理；(3) METH + rTMS組（真刺激組），CPP行為發(fā)生消退后，給予大鼠為期1天的真刺激處理。刺激結(jié)束后24 h，進(jìn)行復(fù)吸測(cè)試。

實(shí)驗(yàn)二：探索慢性高頻（10Hz）rTMS對(duì)大鼠CPP復(fù)吸的影響。將大鼠隨機(jī)分成三組：SAL組、METH + sham組和METH + rTMS組，在CPP行為發(fā)生消退后，對(duì)METH + sham組進(jìn)行為期3天的偽刺激處理，而對(duì)METH + rTMS組進(jìn)行為期3天的真刺激處理。刺激結(jié)束后24 h，進(jìn)行復(fù)吸測(cè)試。

刺激參數(shù)及真假刺激方式見下文。兩次實(shí)驗(yàn)的條件都是對(duì)照嚴(yán)格一致的，實(shí)驗(yàn)大鼠數(shù)量、體重、生理鹽水對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)流程、實(shí)驗(yàn)環(huán)境等都是嚴(yán)格一致的。也就是說，兩次實(shí)驗(yàn)，除了最后rTMS的刺激天數(shù)不同，其余均在同一條件下進(jìn)行。

2.5 rTMS儀器與刺激方案

rTMS刺激儀器和線圈購自武漢依瑞德公司，其中線圈內(nèi)徑2.5 cm，外徑5 cm。在實(shí)驗(yàn)中，急慢性rTMS刺激均是每日進(jìn)行兩次刺激，上下午各一次，每次給予500個(gè)刺激，中間間隔6 h，每日共計(jì)1000個(gè)刺激數(shù)。其中，刺激頻率為10 Hz，刺激串為20，串刺激數(shù)為25，串間隔為15 s。刺激強(qiáng)度均為30%最大輸出功率，相當(dāng)于100% RMT。真刺激組大鼠在刺激時(shí)，使線圈中心緊貼頭皮，對(duì)準(zhǔn)大鼠顱骨頂；而假刺激組的線圈置于大鼠頭頂上8 cm，確保大鼠能夠感受到線圈的噪音但不會(huì)接收到磁場(chǎng)刺激。在刺激期間，用手固定大鼠，限制其運(yùn)動(dòng)。另外，為了排除刺激時(shí)的噪音及固定方式對(duì)大鼠產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，在實(shí)驗(yàn)開始前，我們每天對(duì)大鼠進(jìn)行12 min的rTMS假刺激，連續(xù)刺激1周，使大鼠適應(yīng)rTMS的操作程序。實(shí)驗(yàn)期間，rTMS真假刺激均不會(huì)導(dǎo)致大鼠發(fā)生癲癇或其他明顯的行為異常。

2.6 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用雙因素方差分析（two-way ANOVA)、Bonferroni post hoc多重比較檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。p < 0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果以均值（標(biāo)準(zhǔn)誤）的形式呈現(xiàn)。

3．結(jié)果

3.1 0.5mg/ml的甲基苯丙胺能夠成功誘發(fā)大鼠CPP的復(fù)吸行為

實(shí)驗(yàn)流程如表1所示，將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成3組：Con組(n=6)，METH 1組(n=6) 和METH 2組(n=5)，各組處理情況見圖2A。

各組CPP得分及統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2a和表2b所示。研究表明，應(yīng)用劑量為1 mg/ml的METH進(jìn)行條件化訓(xùn)練，能夠成功建立起甲基苯丙胺誘導(dǎo)的條件性位置偏愛模型，經(jīng)過消退訓(xùn)練后，腹腔注射0.5 mg/ml 的METH能夠成功誘發(fā)大鼠的復(fù)吸行為（圖2B），METH 2 vs. Con, t (42) = 3.31, p = 0.006; 而生理鹽水則不能誘發(fā)，METH 1 vs. Con, t (42) = 0.79, p >0.999。

3.2 急性rTMS不能顯著抑制CPP的復(fù)吸行為

各組大鼠在三次測(cè)試中的CPP得分及統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3a和表3b所示。結(jié)果表明，在大鼠的條件性位置偏愛行為發(fā)生消退后，給予1天的rTMS處理，能夠在一定程度上抑制成癮大鼠的復(fù)吸行為，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3C），METH + rTMS vs.METH + sham, t (72) = 1.48, p = 0.431。

說明急性rTMS對(duì)成癮大鼠的復(fù)吸行為可能具有一定的抑制作用，但是否有效需要進(jìn)一步地探索。

3.3 慢性rTMS能夠顯著抑制CPP的復(fù)吸行為

各組大鼠在三次測(cè)試中的CPP得分及統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4a和表4b。結(jié)果提示，大鼠的條件性位置偏愛行為發(fā)生消退后，連續(xù)給予3天的rTMS處理，能夠抑制成癮大鼠的復(fù)吸行為（圖4C）：METH+rTMS vs. SAL, t (69) = 0.63, p > 0.999; METH + rTMS vs. METH + sham, t (69) =3.33, p = 0.004。

表1．大鼠條件性位置偏愛復(fù)吸模型實(shí)驗(yàn)流程

由此說明，慢性rTMS能夠抑制甲基苯丙胺成癮大鼠的復(fù)吸行為。

4．討論

4.1 主要發(fā)現(xiàn)

物質(zhì)成癮目前被認(rèn)為是一種病理性的學(xué)習(xí)記憶過程。成癮物質(zhì)會(huì)使成癮者的大腦結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，使得成癮者在戒斷期對(duì)藥物相關(guān)線索異常敏感，極易產(chǎn)生渴求，誘發(fā)復(fù)吸行為[19]。

條件性位置偏愛實(shí)驗(yàn)是目前評(píng)價(jià)藥物精神依賴性的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停且环N基于巴普洛夫條件反射的學(xué)習(xí)記憶過程[20]。該成癮模型能夠很好地模擬現(xiàn)實(shí)中人的成癮情況，主要包括三大階段：成癮記憶的形成、消退和復(fù)吸。這種基于巴普洛夫條件反射形成的成癮性記憶非常牢固，而消退性記憶則較脆弱，因而在CPP消退后，當(dāng)動(dòng)物再次接觸藥物相關(guān)線索時(shí)，會(huì)很容易誘發(fā)出復(fù)吸行為[21]，如圖2所示。

大量研究表明，rTMS刺激大腦時(shí)，可以引起突觸可塑性的改變，表現(xiàn)為長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-time potentiation, LTP） 和 長(zhǎng) 時(shí) 程 抑 制 (long-time depression，LTD)。目前一些理論認(rèn)為，rTMS的這種作用效果主要與刺激頻率和刺激強(qiáng)度密切相關(guān)，高頻刺激會(huì)誘發(fā)LTP，而低頻刺激則會(huì)誘發(fā)LTD[6,22]。而本研究在條件性位置偏愛行為發(fā)生消退后，對(duì)大鼠進(jìn)行高頻rTMS刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性高頻rTMS能夠抑制成癮大鼠的復(fù)吸行為。這可能是因?yàn)楦哳l磁刺激誘發(fā)的LTP作用，增強(qiáng)了大鼠的消退性記憶，從而預(yù)防了復(fù)吸行為的發(fā)生。而急性高頻磁刺激雖然沒能成功抑制住大鼠的復(fù)吸行為，但與假刺激組相比，有一定的抑制趨勢(shì)。結(jié)合實(shí)驗(yàn)一與實(shí)驗(yàn)二，說明rTMS的這種抑制作用需要足夠的磁刺激量。

圖2．METH（0.5mg/ml）成功誘發(fā)大鼠條件性位置偏愛的復(fù)吸行為

表2a．CPP復(fù)吸模型，三組大鼠三次測(cè)試之間的比較

表2b．CPP復(fù)吸模型，各組大鼠CPP得分比較

圖3．急性rTMS處理對(duì)CPP復(fù)吸行為的作用

表3a．實(shí)驗(yàn)一，三組大鼠三次測(cè)試之間的CPP得分比較

表3b．實(shí)驗(yàn)一，各組大鼠CPP得分組內(nèi)比較

圖4．慢性rTMS處理對(duì)CPP復(fù)吸行為的作用

表4a．實(shí)驗(yàn)二，各組大鼠三次測(cè)試之間的CPP得分比較

表4b．實(shí)驗(yàn)二，各組大鼠CPP得分組內(nèi)比較

4.2 研究局限性

首先，本研究進(jìn)行了一次復(fù)吸測(cè)試，如有可能，還可以往后每隔幾天再測(cè)一次，觀察rTMS刺激的持久性。其次，因?qū)嶒?yàn)條件的局限性，一批實(shí)驗(yàn)?zāi)茏龅拇笫髷?shù)量有限，本來可以通過一次實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)急慢性rTMS對(duì)復(fù)吸行為的作用，但本研究分成了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)來探索。第三，本研究中rTMS刺激參數(shù)是通過參考多個(gè)實(shí)驗(yàn)研究最終制定的。該研究目前僅僅探索了高頻磁刺激對(duì)CPP復(fù)吸行為的影響，但是其他刺激模式如低頻刺激等對(duì)復(fù)吸行為的作用還有待進(jìn)一步探索。

4.3 研究意義

本研究分別探索了急慢性rTMS對(duì)甲基苯丙胺誘導(dǎo)的條件性位置偏愛復(fù)吸行為的影響，發(fā)現(xiàn)rTMS能夠抑制成癮的復(fù)吸行為，為日后臨床上應(yīng)用rTMS治療物質(zhì)成癮提供一個(gè)初步的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。未來的研究可以結(jié)合臨床研究探索不同rTMS刺激模式對(duì)物質(zhì)依賴的影響及其作用機(jī)制。

資金來源

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“重大慢性非傳染性疾病防控研究”（2017YFC1310400），國家自然基金聯(lián)合基金重點(diǎn)項(xiàng)目（U1502228），國家自然科學(xué)基金（81771436），上海市衛(wèi)生計(jì)生委聯(lián)合攻關(guān)及適宜項(xiàng)目（2014ZYJB0002），上海市科技人才計(jì)劃項(xiàng)目（17XD1403300），上海精神障礙重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（13DZ2260500），上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)（精神病學(xué)）重點(diǎn)學(xué)科（2017ZZ02021）。

利益沖突

本研究不涉及任何利益沖突。

倫理審批

中國科學(xué)院動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)批準(zhǔn)本研究。所有實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究方案》。

作者貢獻(xiàn)

武學(xué)慶設(shè)計(jì)實(shí)施本實(shí)驗(yàn)，并完成初稿。

居云悅、焦東亮參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。

趙敏負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和稿件修改。

所有作者閱讀并同意終稿的發(fā)表。