蘇文雨 王吉林 房靜遠(yuǎn)

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科 上海市消化疾病研究所(200001)

背景：S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶1(AMD1)是調(diào)控多胺代謝的限速酶，多胺代謝異常可引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。目前多胺代謝已成為近年腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目的：探討AMD1在胃癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性。方法：采用免疫組化法檢測72例胃癌及其癌旁組織中的AMD1表達(dá)，并分析其與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性。培養(yǎng)胃癌細(xì)胞MGC803，以AMD1-siRNA和AMD1抑制劑MGBG分別干預(yù)胃癌細(xì)胞，CCK-8法檢測胃癌細(xì)胞增殖情況。結(jié)果：AMD1在65.3%的胃癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤直徑、腫瘤浸潤深度密切相關(guān)(P<0.05)，而與患者性別、年齡、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性(P>0.05)。以AMD1-siRNA和MGBG干預(yù)胃癌細(xì)胞后，細(xì)胞增殖力均明顯下降(P<0.05)。結(jié)論：AMD1在胃癌中的表達(dá)升高，與腫瘤直徑和腫瘤浸潤深度密切相關(guān)；AMD1通過影響細(xì)胞增殖而參與胃癌的發(fā)生，有望成為胃癌診斷和治療的新靶點(diǎn)。

Background:Adenosylmethionine decarboxylase 1 (AMD1) is a rate-limiting enzyme in the regulation of polyamine metabolism. Abnormal polyamine metabolism can lead to the cell malignant transformation. Polyamine metabolism has become a hot topic in the field of tumor research in recent years.Aims:To investigate the expression and correlation of AMD1 with clinicopathological characteristics in gastric cancer.Methods:The expression of AMD1 in gastric cancer tissue and paracancerous tissue were detected by immunohistochemical staining, and its correlation with clinicopathological characteristics of gastric cancer was analyzed. Gastric cancer cell MGC803 was cultured, AMD1-siRNA and AMD1 inhibitor MGBG were used to intervene the gastric cancer cell, and cell proliferation was assessed by CCK-8 assay.Results:AMD1 was highly expressed in 65.3% of gastric cancer, and its expression was closely related to tumor diameter and tumor depth of infiltration (P<0.05), but not related to gender, age, TNM staging, lymph node metastasis, and distant metastasis (P>0.05). After intervention with AMD1-siRNA or MGBG, cell proliferation of MGC803 cells were significantly decreased (P<0.05). Conclusions:AMD1 is highly expressed in gastric cancer and correlated with the tumor diameter and depth of infiltration. AMD1 is involved in development of gastric cancer through regulation of cell proliferation, and is expected to be a new target for the diagnosis and treatment of gastric cancer.

多胺(polyamine)包括精脒(spermidine)、精胺(spermine)和腐胺(putrescine)，是廣泛存在于真核細(xì)胞的一類低分子脂肪族陽離子化合物，是細(xì)胞生長的必需組分，是合成核酸、蛋白質(zhì)所必需的一種調(diào)控物質(zhì)。多胺可通過與帶負(fù)電荷的生物大分子結(jié)合，影響DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的功能，從而廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、修飾蛋白激酶等過程[1]。腫瘤的快速生長也有賴于細(xì)胞內(nèi)多胺含量，其代謝異常亦可引起細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，目前多胺代謝過程已成為近年腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[2]。S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶1(adenosylmethionine decarboxylase 1, AMD1)又稱為SAMDC，是調(diào)控多胺代謝的限速酶[3-4]。在淋巴瘤中，AMD1通過調(diào)節(jié)真核細(xì)胞翻譯起始因子5A(eIF5A)翻譯后修飾來發(fā)揮抑癌基因的作用[5]；在前列腺癌中，AMD1通過調(diào)控mTOR通路影響腫瘤細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[6]；AMD1在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中亦起有重要作用[3]。但AMD1在胃癌中的表達(dá)及其作用的報道目前較少見。本研究通過檢測AMD1在胃癌及其癌旁組織中的表達(dá)，并分析其與臨床病理特征的相關(guān)性，同時通過抑制胃癌細(xì)胞中AMD1的表達(dá)和活性，檢測胃癌細(xì)胞增殖情況，旨在為探討AMD1在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、資料來源

組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司，包含72例胃癌組織及其癌旁組織，其中男性40例，女性32例，診斷均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)。

二、研究方法

1. 免疫組化染色：組織芯片以3% H2O2預(yù)處理15 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，并以檸檬酸鹽緩沖液微波加熱修復(fù)15 min后自然冷卻至室溫。滴加非免疫性山羊血清，室溫封閉30 min。滴加抗AMD1抗體(Sigma-Aldrich，工作濃度為1∶50)，4 ℃濕盒過夜后復(fù)溫30 min，并以PBS緩沖液漂洗3次。滴加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，自然晾干后中性樹膠封片。

結(jié)果判斷：細(xì)胞核呈棕褐色者為AMD1陽性細(xì)胞。隨機(jī)選取5個高倍視野(×400)，計數(shù)陽性細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)量分為四級：0級，無陽性細(xì)胞；1級，1～5個；2級，6～15個；3級，>15個。0級為AMD1不表達(dá)，1級為低表達(dá)，2～3級為高表達(dá)。

2. 細(xì)胞株、主要試劑：人胃癌細(xì)胞株MGC803(購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心，由上海市消化疾病研究所保存)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Thermo Fisher Scientific)；HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑(QIAGEN)，AMD1抑制劑MGBG(北京北實(shí)縱橫科技發(fā)展有限公司)，AMD1-siRNA序列：正義鏈：5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3’，反義鏈：5’-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3’；Cell Counting Kit 8(CCK-8)試劑盒(同仁化學(xué)研究所)。

3. 細(xì)胞培養(yǎng)和干預(yù)：將MGC803細(xì)胞培養(yǎng)于含5%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，生長至對數(shù)生長期后，按1.0×104個/孔的密度接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁密度達(dá)70%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

siRNA干預(yù)組：取0.5 μL預(yù)先配好的2 μmol/L siRNA(control-siRNA 或AMD1-siRNA)溶于2 μL去RNase水中，將0.75 μL HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑加入24.25 μL無血清培養(yǎng)基中，混勻siRNA和轉(zhuǎn)染試劑，常溫孵育10 min，然后加入96孔板中與無血清培養(yǎng)基混勻。37 ℃培養(yǎng)6 h后更換為含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

AMD1抑制劑干預(yù)組：取DMSO或MGBG各0.2 μL加入無血清培養(yǎng)基，使藥物終濃度達(dá)10 μmol/L,取100 μL分別加入96孔板中，37 ℃培養(yǎng)6 h后更換為含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

4. CCK-8法：取MGBG或AMD1-siRNA干預(yù)48 h 的細(xì)胞，在避光條件下，將無血清RPMI-1640培養(yǎng)基與CCK-8試劑按9∶1的體積比混勻。吸去原有培養(yǎng)基，每孔加入100 μL上述CCK-8稀釋液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育40 min；于波長450 nm處，上酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度(A)值，計算細(xì)胞增殖力。細(xì)胞增殖力(%)=(干預(yù)組A450 nm-空白組A450 nm)/(對照組A450 nm-空白組A450 nm)×100%，每組設(shè)3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、AMD1在胃癌中的表達(dá)

72例胃癌患者中，與癌旁組織相比，胃癌組織AMD1表達(dá)明顯升高(P<0.01)(圖1)。

圖1AMD1在胃癌及其癌旁組織中的表達(dá)(免疫組化染色，×200)

二、AMD1表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

72例胃癌患者中，47例(65.3%)AMD1呈高表達(dá)，且與腫瘤直徑、腫瘤浸潤深度密切相關(guān)(P<0.05)，而與患者性別、年齡、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性(P>0.05)(表1)。

表1 AMD1表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系(n)

三、AMD1對胃癌細(xì)胞增殖的影響

以AMD1-siRNA和AMD1抑制劑MGBG分別干預(yù)胃癌細(xì)胞MGC803后，胃癌細(xì)胞增殖力均較對照組明顯降低(圖2)。

討 論

胃癌是引起全球腫瘤患者死因的第三大腫瘤[7]，其發(fā)生是一個涉及多因素、多步驟的病理過程，具體發(fā)病機(jī)制尚待進(jìn)一步探討。多胺在器官發(fā)育、炎癥、腫瘤、糖尿病、干細(xì)胞、腎臟疾病等生理和病理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[8-9]，腫瘤細(xì)胞的快速增殖、遷移和侵襲能力依賴細(xì)胞內(nèi)高濃度多胺，且腫瘤組織中多胺含量高是患者預(yù)后不良的重要指標(biāo)[3,10-13]。AMD1主要通過催化S-腺苷甲硫氨酸脫羧產(chǎn)生脫羧S-腺苷甲硫氨酸，為精脒和精胺的生成提供氨丙基基團(tuán)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多胺水平。Gupta等[3]的研究發(fā)現(xiàn)沉默AMD1表達(dá)后，可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞MCF7增殖和侵襲能力；Paasinen-Sohns等[14]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)AMD1可通過誘導(dǎo)異常血管形成促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移；Zhang等[15]報道，AMD1在調(diào)節(jié)干細(xì)胞的自我更新和分化中亦發(fā)揮重要作用。

圖2AMD1-siRNA和AMD1抑制劑MGBG對胃癌細(xì)胞MGC803增殖的影響(CCK-8法)

本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，AMD1在胃癌中的表達(dá)明顯上調(diào)，且AMD1高表達(dá)與腫瘤直徑、腫瘤浸潤深度密切相關(guān)(P<0.05)，而與患者性別、年齡、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性(P>0.05)，提示AMD1與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。MGBG為AMD1的競爭性抑制劑，可抑制精脒和精胺的生物合成。本研究以MGBG干預(yù)胃癌細(xì)胞，結(jié)果顯示抑制AMD1活性后，胃癌細(xì)胞增殖力明顯下降；同時以siRNA下調(diào)AMD1表達(dá)，胃癌細(xì)胞增殖力亦下調(diào)。提示AMD1一方面通過改變自身酶活性發(fā)揮調(diào)控的作用，另一方面通過改變自身表達(dá)來參與細(xì)胞增殖力的調(diào)控。eIF5A是重要的真核細(xì)胞蛋白翻譯起始因子，其主要功能是促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯的延伸，eIF5A的羥腐胺賴氨酸修飾是其激活的前提，細(xì)胞中多胺含量可改變eIF5A的羥腐胺賴氨酸修飾程度，從而影響eIF5A的活性[16]。eIF5A通過調(diào)控E-cadherin、MTA1、c-Myc等基因參與多種腫瘤的過度增殖[17-18]。Sievert等[19]發(fā)現(xiàn)eIF5A的促癌作用與多胺過表達(dá)密切相關(guān)；推測AMD1在胃癌中的調(diào)控作用可能是通過多胺代謝激活eIF5A繼而調(diào)控相關(guān)癌基因的過表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，但具體調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之，以多胺-羥腐胺賴氨酸軸為中心的多胺代謝網(wǎng)絡(luò)在真核生物中廣泛存在，該網(wǎng)絡(luò)紊亂與許多腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，多胺代謝途徑中的限速酶已成為近年抗腫瘤治療和分子靶向藥物研發(fā)的新靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者AMD1表達(dá)升高，且與腫瘤直徑、浸潤深度密切相關(guān)，且AMD1能通過兩種方式參與調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖力。隨著對AMD1在胃癌發(fā)生中作用的研究的進(jìn)一步深入，其有望成為胃癌診斷和治療的新靶點(diǎn)。