邵華榮，房紹英，吳季栩，劉 飛，馬 河，凌沛學(xué)，程艷玲

（山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101）

多糖口服具有抗疲勞、抗抑郁、保肝、抗瘧疾、調(diào)血脂、提高免疫力等藥理活性[1-4]。本課題組前期研究證實(shí)，人參多糖口服可提高免疫力，貽貝多糖口服具有顯著調(diào)血脂活性，但藥動(dòng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，兩者口服原型多糖生物利用度極低。深入探索多糖類(lèi)藥物口服生物利用度低與其良好活性之間的關(guān)聯(lián)，應(yīng)首先對(duì)多糖口服后的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程進(jìn)行研究。大鼠原位單向腸灌流模型，是研究藥物吸收代謝的重要模型之一[5-7]，我們采用此模型對(duì)人參多糖與貽貝多糖口服后在腸道內(nèi)的降解進(jìn)行了研究。

1 材料

1.1 儀器

AUW-120D電子分析天平，LC-20AT高效液相色譜儀，RID-20AT示差折光檢測(cè)器（日本島津）；高速微量冷凍離心機(jī)（美國(guó)賽默飛世爾）；加比士C6T微量注射泵（浙江史密斯醫(yī)學(xué)儀器公司）；DK-98-II電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器公司）。

1.2 試藥

貽貝多糖（山東省藥學(xué)科學(xué)院自制，批號(hào)20160501）；人參多糖（山東省藥學(xué)科學(xué)院自制，批號(hào)20161222）；無(wú)水氯化鈣，葡萄糖，NaCl，KCl，NaHCO3，NaH2PO4，MgCl2，均為國(guó)產(chǎn)分析純。Krebs-Ringer緩沖液為灌流液（簡(jiǎn)稱K-R試液），其組成為：NaCl 133.5 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl23.3 mmol/L，NaH2PO42.67 mmol/L，MgCl20.21 mmol/L，NaHCO316.3 mmol/L，D-葡萄糖7.8 mmol/L。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠12只，體重范圍190～210 g，雌雄各半，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供。飼養(yǎng)條件：SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)，每籠5只，室溫19～26 ℃，濕度40 %～70 %，日溫差≤4 ℃，換氣次數(shù)8～10次/h，晝夜明暗交替時(shí)間12 h/12 h，試驗(yàn)前適應(yīng)飼養(yǎng)7 d。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（魯）2014 0008。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

兩種多糖含量均采用HPLC-示差折光檢測(cè)器進(jìn)行分析。

貽貝多糖分析條件：色譜柱型號(hào)TSK-GEL G5000PWXL，流動(dòng)相為0.05 mol/L 硝酸鈉溶液，流速0.5 ml/min，柱溫40 ℃，檢測(cè)器溫度35 ℃，進(jìn)樣量20 μl。貽貝多糖相對(duì)保留時(shí)間約11.7 min，線性關(guān)系良好（r=0.9992），線性范圍為0.25～1.5 mg/ml，RSD≤6.22 %，回收率為96.58 %～107.41 %。

人參多糖分析條件：TSK-GEL G3000PWXL，流動(dòng)相為0.05 mol/L 磷酸二氫鈉溶液，流速：0.6 ml/min，柱溫：35 ℃，檢測(cè)器溫度40 ℃。人參多糖相對(duì)保留時(shí)間約11.8 min，線性關(guān)系良好（r=0.9986），線性范圍為0.25～1.5 mg/ml，RSD≤5.78 %，回收率為90.60 %～111.22 %。

2.2 大鼠原位腸灌流試驗(yàn)

取12只SD大鼠，其中貽貝多糖及人參多糖灌流組各6只，雌雄各半，試驗(yàn)前禁食12 h以上，自由飲水，腹腔注射1 %戊巴比妥溶液40 mg/kg，麻醉后固定，沿腹中線剖開(kāi)腹部，分別小心分離選取待考察腸段（十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸），并于兩端切小口，以37 ℃生理鹽水沖凈腸腔后插管并用手術(shù)線結(jié)扎，管路進(jìn)出口處于同一高度， 傷口用浸有生理鹽水的紗布覆蓋保濕并用手術(shù)燈照射保持體溫[5]。腸段劃分方法：十二指腸段為距幽門(mén)1 cm處起；空腸段為距幽門(mén)15 cm處起；回腸段為盲腸部位上行20 cm處起；結(jié)腸段為緊鄰盲腸后端起至直腸，各段均取10 cm左右。

各腸段先用一定濃度的多糖灌流液以0.2 mL/min流速灌流20 min后，保持流速不變，改用已稱重裝有多糖溶液的注射器進(jìn)行腸灌流，同時(shí)出口處用已稱重的接液瓶接收灌流液，以首滴接收液滴下算起，收集15 min的接收液，將接液瓶稱重并記錄。采用質(zhì)量法校正腸內(nèi)水分吸收引起的灌流液體積的變化，計(jì)算泵入供試液體積Vin=min/ρin（泵入腸內(nèi)供試液質(zhì)量min，測(cè)定密度為ρin），接收液體積Vout=mout/ρout（接收到的灌流液質(zhì)量mout，測(cè)定密度為ρout），Vin與Vout的差異即是腸道吸收或分泌的水分的體積。供試液及接受液內(nèi)多糖測(cè)定按2.1項(xiàng)方法進(jìn)行。處死大鼠，輕柔剪下被考察腸段，以手術(shù)線附著法測(cè)量長(zhǎng)度（l）和周長(zhǎng)，計(jì)算內(nèi)徑（r）。

按以下公式計(jì)算藥物的降解速率常數(shù)（Ka）及降解百分率（P%）[5]。

公式中，v為灌流速度（ml/min），Cin、Cout為供試液及接收液的多糖藥物濃度（mg/L），l和r為灌流腸段的長(zhǎng)度（cm）和半徑（cm）。

2.3 貽貝多糖在不同腸段的降解

10 mg/ml貽貝多糖在各腸段的降解情況見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，十二指腸段各接收液樣本均未見(jiàn)貽貝多糖色譜峰，表明貽貝多糖在十二指腸可全部被降解，在空腸段的降解百分率為40.33 %±15.65 %，在回腸和結(jié)腸部位，貽貝多糖降解百分率較低，分別為0.70 %±0.49 %和0.30 %±0.14 %，表明大分子貽貝多糖原型在回腸和結(jié)腸較難吸收或降解。

表1 各腸段對(duì)貽貝多糖的降解

2.4 人參多糖在不同腸段的降解

6 mg/ml人參多糖在各腸段的降解情況見(jiàn)表2。人參多糖在各腸段均有不同程度的降解，其中，回腸部位的降解百分率較大，為52.41 %±13.14 %，結(jié)腸部位降解較少，僅為0.68 %±0.54 %。十二指腸和空腸部位的降解百分率分別為25.19 %±17.02 %和33.04 %±15.26 %。

表2 各腸段對(duì)人參多糖的吸收

3 討論

本研究采用HPLC結(jié)合示差折光檢測(cè)器，分別建立了測(cè)定大鼠腸灌流液中貽貝多糖和人參多糖原型含量的方法，該法線性范圍為0.25～1.5 mg/ml，回收率和精密度良好，可用于兩種多糖類(lèi)藥物大鼠在體腸灌流試驗(yàn)研究。

本課題組前期藥代動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，貽貝多糖口服及人參多糖口服并未在血漿中檢測(cè)到多糖原型，而本研究發(fā)現(xiàn)兩種多糖在腸灌流流出液中含量均大幅降低，因此，推測(cè)兩種多糖是在腸道內(nèi)發(fā)生了降解。相比于采用模擬腸液進(jìn)行多糖體外降解試驗(yàn)，大鼠原位在體腸灌流模型可全面地包含腸內(nèi)多糖降解酶，更為科學(xué)合理。

貽貝多糖在十二指腸段的降解百分率為100 %，這可能是因?yàn)橘O貝多糖（Mr1.20×106）主鏈中含α 1→4糖苷鍵，為胰淀粉酶的作用靶點(diǎn)，因此，推測(cè)貽貝多糖口服發(fā)揮調(diào)血脂活性的可能是其寡糖。人參多糖（Mr2.9×104）在各腸段均存在部分降解，在回腸內(nèi)的降解百分率最大，約52 %，說(shuō)明人參多糖調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的作用可能是其寡糖和部分多糖。由此也證實(shí)，在多糖口服活性與作用機(jī)制研究中，將多糖直接加入體外細(xì)胞培養(yǎng)體系中進(jìn)行的相關(guān)研究，與多糖類(lèi)藥物口服后的體內(nèi)作用途徑相差甚遠(yuǎn)[8]。

兩種多糖類(lèi)藥物降解形成的寡糖是否可被吸收尚需進(jìn)一步研究，而另一方面，腸道菌群可能是多糖及其寡糖作用的腸內(nèi)靶點(diǎn)。近年，腸道菌群與機(jī)體免疫及各種慢性疾病之間的關(guān)系得到充分證實(shí)[9-10]，而多糖和寡糖作為腸道菌群的底物，可能對(duì)菌群的定植和代謝起到非常重要的作用。將多糖消化道轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程與其對(duì)腸道菌群的影響相結(jié)合，對(duì)闡明多糖口服的作用途徑具有重要意義。