復合酶酶解蜈蚣粉工藝優(yōu)化

王彥多，桑 曉，方 園，劉 穎，曹廣超，毛會秀，劉金虎，王集會

（1. 山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2. 山東中醫(yī)藥大學實驗中心，山東 濟南 250355）

蜈蚣入藥首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味辛，性溫，有毒，歸肝經(jīng)[1]。蜈蚣于《本草綱目》中記載具有祛風止痙，通絡止痛，攻毒散結的功效[2]?，F(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)蜈蚣的毒性主要集中于其牙部[3]。蜈蚣雖具有一定毒性，但其具有較強的通絡散結攻毒之效。因此，近現(xiàn)代以來，許多國醫(yī)大師都善用蜈蚣治療惡性腫瘤[4]，認為其獨特的“以毒攻毒”療效具有不可替代的作用。

現(xiàn)階段蜈蚣抗腫瘤效果成為其藥理作用的研究熱點，研究發(fā)現(xiàn)，蜈蚣具有抑制腫瘤細胞增殖、增強機體免疫力等作用[5]。其主要通過破壞癌細胞細胞膜使其破裂的方式殺死癌細胞[6]?，F(xiàn)階段對蜈蚣的研究主要集中于蜈蚣全蟲，而對蜈蚣生物轉化后的產(chǎn)物活性研究則鮮有文獻報道。劉春雨等[7]探討了不同酶解產(chǎn)物對乳腺癌MCF-7細胞的增殖抑制效果，結果顯示半仿生酶解方法可提高蜈蚣抗腫瘤效果。因此，本實驗在已篩選出有效用酶的基礎上進行復合酶酶解工藝的優(yōu)化，探究各因素對蜈蚣粉酶解的影響，并期望通過工藝優(yōu)化達到提高蜈蚣粉酶解產(chǎn)物對乳腺癌MCF-7細胞抑制率的效果。

1 儀器與材料

1.1 儀器

FA1004N型電子分析天平（上海精密儀器公司）；HWLC型電熱恒溫水溫箱（北京醫(yī)療設備廠)；PHS-25型pH計（上海儀電科學儀器公司）；KDN-2C定氮儀配四孔消化爐（上海纖檢儀器公司）；UV9100B可見分光光度計（北京萊伯泰科儀器公司）；EL340i型全自動酶標儀（Molecular Davices）；TS100型倒置顯微鏡（日本尼康）。

1.2 材料

蜈蚣凍干粉自制（批號：20160703）；胰蛋白酶（5×104U/g，國藥集團）；胰凝乳蛋白酶（上海源葉，批號：G2207Y23138）；彈性蛋白酶（3×104U/g，上海源葉，批號：Y30M8T32945）；RPMI-1640培養(yǎng)基，胎牛血清（賽默飛世爾）；胰凝乳蛋白酶（106U/g，上海碧云天）；注射用順鉑（齊魯制藥，純度：20 mg/支）；MTT（武漢蓋云天）。

1.3 細胞株

乳腺癌MCF-7細胞株由山東省立醫(yī)院提供。

2 方法

2.1 正交試驗水平設計

根據(jù)劉春雨等[7]前期單因素篩選試驗并參考焦方文等[8]方法，確定以酶解溫度、酶解時間、pH值及單個酶酶活力為考察因素，按L16（44）正交表進行正交試驗。取蜈蚣粉1.0000 g，以對蜈蚣粉復合酶酶解液對乳腺癌MCF-7細胞的增殖抑制率為指標，進行4因素4水平的正交試驗。因素水平設計見表1。

表1 蜈蚣粉酶解工藝正交試驗設計

2.2 蜈蚣粉酶解方法

精密稱取蜈蚣粉3份，每份1.0000 g，分別置入100 ml具塞錐形瓶，按料液比1:40加入蒸餾水。超聲提取30 min，然后按各正交試驗條件進行酶解，復合酶比例為胰蛋白酶:彈性蛋白酶:胰凝乳蛋白酶=1:1:1。酶解結束后，以3000 r/min 轉速離心，取復合酶酶酶解上清，冷凍干燥。

2.3 乳腺癌MCF-7細胞的培養(yǎng)

2.3.1 細胞復蘇 從液氮罐中取出凍存的MCF-7細胞，置于37 ℃ 水浴鍋中使其融化。取出細胞，1000 r/min離心。離心后向離心管中加入1640 培養(yǎng)基，吹打使其混勻，轉移至培養(yǎng)瓶中，加入適量1640培養(yǎng)基，24 h后換液[9]。

2.3.2 細胞傳代 待細胞增殖至80 %～90 % 時，進行細胞傳代。首先用0.01 mol/L pH 7.4的PBS緩沖溶液清洗3次，然后加入500 μl 0.25 %胰蛋白酶溶液進行消化。將培養(yǎng)瓶于超凈臺中放置一段時間，至細胞蜷縮不貼壁時加入1640培養(yǎng)基，輕輕吹打使其成單細胞懸液，分裝至培養(yǎng)瓶中。放置于37 ℃，含5 % CO2和適宜濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.4 MTT法測定蜈蚣粉酶解液凍干粉對乳腺癌MCF-7細胞的抑制率

2.4.1 提取物溶液配制 精密稱取10.00 mg酶解液凍干粉，溶于5 ml 1640培養(yǎng)基，0.22 μm濾膜過濾，用l640培養(yǎng)基依次稀釋，配成2，1，0.5，0.25，0.125 mg/ml溶液。

2.4.2 抑瘤實驗 將處于對數(shù)生長期的乳腺癌MCF-7細胞消化后稀釋成1×106個/ml的腫瘤細胞懸液，將其接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，于37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)基，空白對照組加不含血清的1640培養(yǎng)基100 μl，陽性對照組加100 μg/ml順鉑100 μl，其他給藥組每孔分別加入不同濃度的藥物100 μl，每個濃度的藥物重復5個孔。然后將細胞放入37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，置于培養(yǎng)箱中避光反應4 h。去除上清，加入DMSO 100 μl，使用酶標儀在492 nm波長處測定OD值，按下式計算藥物對細胞的抑制率，以酶解產(chǎn)物對乳腺癌MCF-7細胞的抑制率為指標進行正交試驗[10]。

3 正交試驗結果及分析

3.1 正交試驗結果

酶解工藝正交試驗結果見表2。

表2 蜈蚣粉復合酶酶解工藝條件正交試驗結果

表3 方差分析表

由極差和方差分析結果可知，4因素對蜈蚣復合酶酶解液對乳腺癌MCF-7細胞的抑制效果均有極顯著性影響，其中酶解溫度影響最大[11]。4因素影響順序為A＞B＞D＞C，即酶解溫度＞酶解時間＞加酶量＞pH值。通過正交試驗結果得到蜈蚣復合酶酶解最佳條件為A2B2C3D3，即酶解溫度35 ℃，酶解時間3 h，pH 8.0，加酶量為2000 U/g[12]。

3.2 最佳工藝條件的驗證

根據(jù)所篩選的最佳工藝條件酶解蜈蚣粉3批，按2.3項方法測定復合酶酶解蜈蚣粉產(chǎn)物對乳腺癌MCF-7細胞的增殖抑制率[13]，3次平均增殖抑制率為61.67 %，RSD為2.93 %，表明工藝穩(wěn)定可行。

4 討論

現(xiàn)階段對蜈蚣中藥的應用主要集中于蜈蚣全蟲，而想要擴大其藥用范圍及價值，采用生物轉化的方式對原有中藥蜈蚣進行加工修飾，是具有創(chuàng)新性的方法。近年對蜈蚣多肽類物質(zhì)的研究成為熱點，前期試驗證明通過通過不同蛋白酶的專屬酶切位點對原有蜈蚣蛋白進行加工修飾及剪切，可得到具有不同分子量及不同抗腫瘤效果的多肽及寡肽肽段。本文在此實驗基礎上采用正交試驗法，選用篩選出的可提高抗腫瘤效果的3種蛋白酶進行復合酶酶解，以酶解產(chǎn)物對乳腺癌MCF-7細胞的增殖抑制率為指標，探究最佳復合酶酶解工藝。最佳工藝為：酶解溫度35 ℃，酶解時間3 h，pH 8.0，加酶量為2000 U/g。

結果顯示，酶解溫度較低時酶解產(chǎn)物對乳腺癌MCF-7細胞的增殖抑制效果較高，隨溫度提升，對MCF-7細胞的增殖抑制率則降低，甚至出現(xiàn)負值現(xiàn)象。分析認為，酶解溫度升高過程中，復合酶酶活性受溫度影響，現(xiàn)分子熱運動加劇趨勢，酶活性會逐漸提高，溫度過高則致使部分活性降低甚至喪失，從而使其抑制腫瘤細胞增殖活性減弱。因此，在使用蜈蚣藥物治療腫瘤疾病時應注意不可高溫蒸煮，以免破壞有效蛋白成分影響治療效果，這為蜈蚣藥物的使用提供了實驗基礎。