陳敬潮　師江龍　張?zhí)K偉

[摘要] 目的 應(yīng)用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)急性白血病細(xì)胞表面CD抗原分子的表達(dá)水平，探討AML和ALL中CD抗原的表達(dá)規(guī)律，為臨床個(gè)體化治療累積分子機(jī)制研究材料。 方法 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)44例急性髓細(xì)胞白血病患者和18例急性淋巴細(xì)胞白血病患者，以CD45/SSC設(shè)門，應(yīng)用13種單克隆抗體對(duì)CD45弱表達(dá)的細(xì)胞群進(jìn)行免疫分型，測(cè)定多種CD分子的表達(dá)率，并通過χ2檢驗(yàn)比較不同的高表達(dá)CD分子的相關(guān)性。 結(jié)果 44例AML患者中表達(dá)且高表達(dá)CD33（79.6%），CD38（70.5%），CD117（52.3%），cyt-MPO（50.0%）；16例B-ALL患者中CD10（75.0%），CD19（81.25%）以及CD22（81.25%）陽性表達(dá)率較高；比較AML患者高表達(dá)CD抗原，結(jié)果顯示CD33/CD38、CD33/cyt-MPO的抗原表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 不同的CD分子在急性白血病細(xì)胞上表達(dá)有差異性，或?qū)榘邢蛑委熀团R床個(gè)體化治療提供有用的線索。

[關(guān)鍵詞] 流式細(xì)胞術(shù)；急性白血病；免疫表型；CD分子；表達(dá)相關(guān)性

[中圖分類號(hào)] R551 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）16-0135-04

[Abstract] Objective To detect the expression level of CD antigen on the surface of acute leukemia cell by multiparameter flow cytometry， and to explore the expression principle of CD antigens in AML and ALL， so as to accumulate molecular mechanism research materials for clinical individualized treatment. Methods 44 patients with acute myeloid leukemia and 18 patients with acute lymphoblastic leukemia were detected by flow cytometry. Based on CD45/SSC， 13 types of monoclonal antibodies were used to carry out immunophenotype of the cell population with weak expression of CD45， and expression rate of various CD molecules was determined. The χ2 test was used to compare the correlation of different highly expressed CD molecules. Results CD33（79.6%）， CD38（70.5%）， CD117（52.3%） and cyt-MPO （50.0%） were highly expressed in 44 patients with AML； the positive rate of CD10（75.0%）， CD19（81.25%）and CD22（81.25%） was higher in 16 patients with B-ALL； the high expression of CD antigens in the patients with AML were compared. The results showed that there was a statistically significant difference in the antigen expression of CD33/CD38 and CD33/cyt-MPO（P<0.05）. Conclusion Different CD molecules are differentially expressed on acute leukemia cells， or they will provide useful clues for targeted therapy and clinical individualized treatment.

[Key words] Flow cytometry； Acute leukemia； Immunophenotype； CD molecules； Expression correlation

急性白血?。╝cute leukemia，AL）根據(jù)FAB協(xié)作組（French-American-British Group）將AL分為兩類，分別是急性髓系細(xì)胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）和急性淋巴系細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）[1]。急性白血病是血細(xì)胞克隆性增殖引起的血液腫瘤，其特點(diǎn)為骨髓中造血細(xì)胞惡性增殖、分化阻滯和凋亡受抑，確切病因至今未明，病毒感染、物理與化學(xué)因素、遺傳因素等都與血液腫瘤的發(fā)生有關(guān)。急性白血病病情發(fā)展很快，如果得不到及時(shí)的診治隨時(shí)可危及生命。傳統(tǒng)的急性白血病的診斷主要是通過骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查和細(xì)胞化學(xué)染色等方法進(jìn)行，然而仍有部分病例由于細(xì)胞形態(tài)學(xué)不典型、細(xì)胞發(fā)育幼稚等而難以明確診斷和分型，而分化的抗原決定簇（CD），在白血病的免疫分型中有著極其重要的地位。CD分子作為免疫分型的表面標(biāo)志物，在細(xì)胞表面的表達(dá)類型和水平可以作為細(xì)胞身份的證明。急性白血病細(xì)胞表面存在有特定種類的CD分子表達(dá)。多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)（multiparameter flow cytometry，MFC）對(duì)白血病、淋巴瘤以及白血病微小病灶殘留病的檢測(cè)非常重要。因此，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)血液腫瘤進(jìn)行免疫分型，對(duì)白血病的MICM診斷以及鑒別診斷均意義重大。

1 資料與方法

1.1一般資料

選擇2014年1月～2017年12月期間我院血液科收治的急性白血?。ˋL）患者62例，診斷符合法美英協(xié)作組（FAB）及2008年世界衛(wèi)生組織（WHO）的診斷標(biāo)準(zhǔn)。男37例，年齡17～86歲，平均46.8歲，女25例，年齡13～72歲，平均45.7歲。其中急性髓系白血?。ˋML）44例，根據(jù)FAB分型劃分為M0 1例，M1 4例，M2 11例，M3 10例，M4 14例，M5 4例；急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）18例，其中B系淋巴細(xì)胞白血病16例，T系淋巴細(xì)胞白血病2例（因樣本例數(shù)少，在此不涉及分析）。

1.2試劑和儀器

IntraPrep Permeabilization Reagent試劑盒，紅細(xì)胞裂解液，以及cyt-MPO、CD3、CD13、CD33、CD34、CD117、CD38、CD10、CD14、CD19、CD20、CD22、CD64和HLA-DR等單克隆抗體購自美國貝克曼公司；BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra流式細(xì)胞儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

采取骨髓標(biāo)本3 mL，肝素抗凝，于各檢測(cè)管中加入相應(yīng)單克隆抗體10 μL，并加入標(biāo)本100 μL，振蕩混勻，室溫避光20～30 min后，加入紅細(xì)胞裂解液（依說明書步驟溶血），混勻避光15 min后，通過流式細(xì)胞儀CD45/SSC設(shè)門對(duì)10000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，通過Flowjo軟件分析細(xì)胞的免疫表型和表達(dá)強(qiáng)度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 不同CD分子在AML患者中的表達(dá)

44例AML患者中各CD分子抗原表達(dá)各有不相同，以表達(dá)百分比>20%為陽性表達(dá)，則cyt-MPO（77.3%），CD34（63.6%），CD33（84.1%），CD117（88.6%），CD38（79.5）在AML患者中表達(dá)較高（表1），將百分比>60%作為高表達(dá)[2]，則CD33（79.6%），CD38（70.5%），CD117（52.3%），cyt-MPO（50.0%）為高表達(dá)，提示這些CD分子在AML診斷中可能具有直接診斷意義，而其他CD分子中度表達(dá)或者低表達(dá)，可能無直接診斷意義，但若其異常表達(dá)則提示某些AML亞型，尤其是CD7分子的異常表達(dá)[3]。

2.2不同CD分子在B-ALL患者中的表達(dá)

16例B-ALL患者中各CD分子抗原表達(dá)也各有不同，以表達(dá)百分比>20%為陽性表達(dá)，則HLA-DR（81.25%），CD19（81.25%），CD22（81.25%），CD10（75.0%）在B-ALL患者中表達(dá)率較高（表2），將百分比>60%作為高表達(dá)，則CD19（68.75%），CD10（56.25%），CD22（50.0%）為高表達(dá)，結(jié)果提示這幾種CD抗原在B型淋巴細(xì)胞白血病的診斷與鑒別診斷上具有重要意義。

2.3 高表達(dá)CD33與CD38、CD117及cyt-MPO在AML患者體內(nèi)表達(dá)的相關(guān)性

將百分比>60%定義為陽性界限，由表1可知CD33、CD38、CD117和cyt-MPO表達(dá)率較高，分別進(jìn)行CD33和CD38、CD117以及cyt-MPO的兩兩比較，結(jié)果顯示CD33與CD38、cyt-MPO的抗原表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而CD33和CD117的抗原表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

2.4 AML患者與ALL患者中CD分子表達(dá)的差異性

44例AML患者與18例ALL患者CD表面抗原相比較，以>20%為陽性表達(dá)，結(jié)果顯示AML患者中CD33、CD117、CD13、以及cyt-MPO陽性表達(dá)率較高，而ALL患者則低表達(dá)或不表達(dá)；ALL患者中CD10、CD19、CD20以及CD22陽性表達(dá)率較高，AML患者則為低表達(dá)或者不表達(dá)；AML與ALL部分患者共表達(dá)CD34和HLA-DR。見表4。

3討論

急性白血病是由造血干細(xì)胞惡性增殖導(dǎo)致的惡性克隆性疾病，盡管在過去幾年治療有了顯著改善，但5年生存率仍然很低[4]。主要原因是治療后體內(nèi)存留一定的殘留細(xì)胞，這是白血病致死的最主要的因素[5]?，F(xiàn)在關(guān)于急性白血病的分型主要還是以形態(tài)學(xué)為主，然而形態(tài)學(xué)受人為因素較大，光鏡下對(duì)細(xì)胞的識(shí)別能力有限，少數(shù)病例難以分型[6]。

免疫表型主要是從造血分化過程中產(chǎn)生的抗原決定簇的角度來分析白血病細(xì)胞克隆的特征以及分化階段。雖然白血病細(xì)胞的形態(tài)不同，但其仍然表達(dá)正常細(xì)胞所具有的特異性抗原。另外，由于白血病細(xì)胞具有腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)，其抗原表達(dá)與正常細(xì)胞不完全相同，存在一定程度的異質(zhì)性，因此其免疫表型也有其自身特點(diǎn)。這種異質(zhì)性有助于對(duì)白血病做出更精確的診斷和分型。隨著單克隆抗體的發(fā)展與使用，對(duì)急性白血病的分型、預(yù)后與指導(dǎo)治療有了很大的提高。

本文采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)AML和ALL表面CD抗原分型，以CD45/SSC設(shè)門，因?yàn)槠渚哂衅渌庖叻中筒豢商鎿Q的優(yōu)勢(shì)。由于CD45是白細(xì)胞表面的共同抗原，通過CD45設(shè)門后可以得到幾乎沒有雜細(xì)胞的白細(xì)胞或有核細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多種CD分子在AL患者中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示不同的CD分子在同一個(gè)體中的表達(dá)差異較大，AML中主要表達(dá)以CD33、CD117、CD13及cyt-MPO髓系抗原表達(dá)為主，提示此四類抗原在判斷白血病細(xì)胞是否來源于髓系上具有很高的診斷價(jià)值，與文獻(xiàn)報(bào)道[7]基本一致。CD33作為髓系前體細(xì)胞的標(biāo)志，同時(shí)在粒系和單核系中均有較高表達(dá)[8]。CD13除表達(dá)在髓系祖細(xì)胞上，還表達(dá)于成熟粒細(xì)胞。CD13和CD33可以被認(rèn)為是識(shí)別髓系常見且敏感的抗原。cyt-MPO是嗜中性粒細(xì)胞中，由嗜中性粒細(xì)胞顆粒產(chǎn)生的過氧化物酶，也是髓樣細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。它在粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中高度表達(dá)，并在單核細(xì)胞白血病中表達(dá)降低，可用于粒細(xì)胞白血病的初步判斷標(biāo)志[9-12]。CD117是C-Kit原癌細(xì)胞的表面分化抗原，正常骨髓細(xì)胞陽性表達(dá)率低于5%。其主要在髓系祖細(xì)胞中表達(dá)。由于其僅在髓系白血病中表達(dá)，通常作為髓系特征性抗原標(biāo)志[13-15]。據(jù)資料顯示，ALL患者的CD117表達(dá)明顯低于AML患者，其髓系特異性明顯優(yōu)于CD13和CD33。CD117的高表達(dá)有利于幫助鑒別髓系白血病與淋系白血病[12]。綜上所述，CD13、CD33、CD117和cyt-MPO在所有類型的AML中均有高表達(dá)，且特異性較高。選擇上述抗原有助于AML的分子免疫診斷。而B-ALL中主要是以CD10、CD19、CD20和CD22抗原表達(dá)為主，提示其在B淋巴細(xì)胞白血病診斷方面具有重要意義。

AML中CD33、CD38、CD117、cyt-MPO這些髓系抗原不僅陽性表達(dá)比例高，而且表達(dá)量也高，具有一定的穩(wěn)定性，在AML的診斷、治療和預(yù)后中具有一定的意義。此外，本實(shí)驗(yàn)還將AML患者中高表達(dá)的CD33/CD38、CD33/CD117和CD33/cyt-MPO進(jìn)行配對(duì)χ2檢驗(yàn)，比較其差異性，結(jié)果顯示CD33/CD38、CD33/cyt-MPO的抗原表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），兩者聯(lián)合檢測(cè)可以提高AML的診斷率，而CD33和CD117的抗原表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

綜上，流式細(xì)胞術(shù)對(duì)白血病的診斷和免疫分型具有重要價(jià)值，但不能作為白血病亞型診斷的獨(dú)立標(biāo)準(zhǔn)，必須結(jié)合MIMIC分型進(jìn)行判斷。盡管近年來隨著單克隆抗體的開發(fā)和應(yīng)用，免疫表型分析在評(píng)價(jià)白血病臨床療效方面具有一定的意義，但仍存在爭(zhēng)議，因此仍需積累大量臨床資料，規(guī)?；?、多方位、多領(lǐng)域多中心研究，以確定某些與治療效果相關(guān)的抗原，為臨床個(gè)體化治療提供有力證據(jù)。

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（收稿日期：2018-02-12）