劉洪旭 鄧思珊 馬麗紅 楊興全 林文津 徐小妹

摘要：目的 采用Illumina HiSeq 4000測序技術(shù)獲得三葉青轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，為三葉青分子生物學(xué)研究提供重要分子信息。方法 以三葉青根和莖葉為材料，進行轉(zhuǎn)錄組測序，對測試數(shù)據(jù)進行基因功能注釋、代謝途徑及微衛(wèi)星等的生物信息學(xué)分析。結(jié)果 共獲得24.13 Gb Clean Data，拼接組裝得到84 433條Unigene，與7個基因數(shù)據(jù)庫進行比對，最終獲得47 766個有注釋信息的Unigene。在GO數(shù)據(jù)庫中注釋27 790條，其根和莖葉的差異表達基因數(shù)目為4989個，其中上調(diào)為3511個，下調(diào)為1478個；COG數(shù)據(jù)庫得到16 152條三葉青Unigene的同源序列，共分為25個類別；在KEGG數(shù)據(jù)庫有14 511條Unigene獲得對應(yīng)的Ko編號，可分為130個信號代謝分支，其中核糖體合成途徑的Unigene數(shù)量最多，有1042條，而異黃酮的生物合成途徑只有1條Unigene。結(jié)論 對三葉青轉(zhuǎn)錄組進行拼接、組裝和功能注釋得到大量轉(zhuǎn)錄本信息，為三葉青分子生物學(xué)研究提供基因組數(shù)據(jù)庫資源。

關(guān)鍵詞：三葉青；轉(zhuǎn)錄組；基因；表達差異

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.018

中圖分類號：R282.5 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）07-0075-04

Abstract： Objective To obtain the transcriptome database and differentially expressed genes of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg. by Illumina HiSeq 4000； To provide important molecular information for its molecular biology research. Methods Leaves and roots of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg. were chosen as experimental materials to conduct transcriptome sequencing. Then bioinformatics analysis of gene function annotations， metabolic pathways， and microsatellites was performed on the test data. Results 24.13 Gb Clean Data were assembled. Afer assembly steps， 84 433 of T. hemsleyanum Unigene were obtained， and then they were compared in the 7 gene database， and 47 766 annotated information of Unigene was obtained. There were 27 790 annotations in the GO database. The number of differentially expressed genes in the roots， stems and leaves was 4989， of which 3511 were up-regulated and 1478 were down-regulated. The COG database obtained 16 152 homologous sequences of Unigene， which were divided into 25 categories. In the KEGG database， there were 14 511 Unigene obtained the corresponding Ko number， which could be divided into 130 branches of signal metabolism， among which the number of Unigene in the ribosome synthesis pathway was the most， with 1042， and there was only 1 Unigene in the biosynthetic pathway of isoflavones. Conclusion A large number of transcripts of the transcriptome were obtained through splicing， assembling and functional annotation of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg.， which can provide genomic database resources for molecular biology research of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg.

Keywords： Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg.； transcriptome； gene； expression difference

三葉青為葡萄科三葉崖爬藤Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg.全草，是我國特有的珍稀中草藥，具有較好的抗炎[1]、抗腫瘤[2-4]等功效，被譽為“植物抗生素”。三葉青的主要活性成分是黃酮和有機酸類化合物。目前對三葉青的研究主要集中在良種選育、栽培技術(shù)管理和活性成分的提取分離，及以細胞和實驗動物為基礎(chǔ)的藥理實驗上，而從分子基因?qū)用嫔蠈Σ煌幱貌课坏乃幮Р町惣按紊x合成通路的研究較少。

隨著基因分析技術(shù)的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以有效揭示細胞的生理活動規(guī)律，探討生物代謝的機理。轉(zhuǎn)錄組是指某一物種或者特定細胞在一個特定的時間段或特定的環(huán)境條件下產(chǎn)生的所有轉(zhuǎn)錄物的集合。利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可以了解基因的功能和結(jié)構(gòu)，揭示器官及細胞在特定生物學(xué)過程中的機制。近年有較多學(xué)者采用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)進行植物的遺傳學(xué)研究，如石斛[5]、山茱萸[6]、紫草[7]、黃芪[8]等。由于環(huán)境破壞及無度采挖，群體結(jié)構(gòu)衰退日趨明顯，野生資源日趨瀕危，因此種質(zhì)資源保護迫在眉睫。利用分子生物學(xué)手段對三葉青的遺傳背景進行研究，可為三葉青遺傳多樣性和分子標(biāo)記等提供信息基礎(chǔ)。

本研究利用高通量測序技術(shù)對三葉青根和莖葉進行轉(zhuǎn)錄組測序，利用生物學(xué)技術(shù)和軟件構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，分析不同部位間的差異表達基因，并對組裝后的測序數(shù)據(jù)進行功能注釋分類、功能聚類及代謝通路挖掘，旨在通過三葉青轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，為三葉青的品質(zhì)鑒定及遺傳資源評價等提供標(biāo)記和序列信息，有助于進一步有效發(fā)掘和鑒定三葉青次生代謝產(chǎn)物合成及其調(diào)控相關(guān)基因，進而了解其有效成分的生物合成途徑及其調(diào)控機制。

1 儀器與試藥

Illumina HiSeq 4000測序儀（美國Illumina公司）。植物總RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號2016-0924），生工生物工程（上海）股份有限公司。三葉青藥材取自福建省閩侯縣白沙種植基地，分為根和莖葉2個部位，采集后迅速用錫箔紙包好，放于干冰中保存?zhèn)溆?。樣品?jīng)福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院劉洪旭副研究員鑒定為葡萄科植物三葉崖爬藤Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg.。

2 方法

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的組裝

提取樣品總RNA，通過Nanodrop測量RNA純度得到A260/A280為1.88，采用Agilent 2100 bioanalyzer（美國Agilent公司）檢測RNA樣品完整性，記錄電泳圖，得到清晰的18 S峰值。反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，構(gòu)建三葉青轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。采用Illumina HiSeq 4000測序儀進行測序，對得到的reads進行數(shù)據(jù)除雜和冗余處理，去除其中的接頭序列及低質(zhì)量Reads，獲得高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)（Clean Data），采用Trinity2.4.0軟件進行序列組裝，得到Unigene數(shù)據(jù)庫。

2.2 轉(zhuǎn)錄組功能預(yù)測

使用BLAST（2004版）軟件將最終得到的Unigene序列與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、PFAM、eggNOG4.5、KEGG數(shù)據(jù)庫比對分析，確定對應(yīng)核苷酸和蛋白質(zhì)的注釋信息。利用Blast2GO軟件（2015年）獲得Unigene的功能注釋和分類。利用富集因子（enrichment factor）分析Pathway的富集程度，并利用Fisher精確檢驗方法計算富集顯著性。

2.3 差異表達基因的篩選

使用EBSeq對Unigene數(shù)據(jù)庫進行差異表達分析，獲得兩樣品之間的差異表達基因集。利用Benjamini-Hochberg方法對原有假設(shè)檢驗得到的顯著性P值（P-value）進行校正，并最終采用校正后的P值（false discovery rate，F(xiàn)DR）作為差異表達基因篩選的關(guān)鍵指標(biāo)，F(xiàn)DR<0.01且差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥2作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 測序結(jié)果與組裝

經(jīng)測序，得到24.13 Gb Clean Data，GC含量不低于47.13%，各樣品Q30堿基百分比均不小于94.18%，各項指標(biāo)均符合轉(zhuǎn)錄組測序要求。用Trinity軟件對樣品數(shù)據(jù)進行序列組裝，共得到84 433條Unigene，N50為1180 bp，其長度集中于200～2000 bp，在200～300 bp長度區(qū)間的數(shù)量占總Unigene序列的42.26%（35 684條），在300～500 bp長度區(qū)間的數(shù)量占總Unigene序列的20.88%（17 632條），大于2000 bp長度區(qū)間的數(shù)量占總Unigene序列的6.64%（5607條）。

3.2 Unigene功能注釋

利用BLAST軟件將Unigene序列分別與8個數(shù)據(jù)庫進行比對分析，最終獲得47 766個有注釋信息的Unigene。其中NR數(shù)據(jù)庫注釋到的Unigene數(shù)量最多，其次是eggNOG數(shù)據(jù)庫，KEGG數(shù)據(jù)庫注釋到的數(shù)量最少。結(jié)果見表1。

3.3 三葉青根和莖葉基因本體GO注釋差異基因分析及聚類

利用GO數(shù)據(jù)庫對注釋到的27 790條Unigene進行比對分析，結(jié)果將其分成細胞組分（20 750條）、生物過程（5012條）、分子功能（46 570條）3個基本功能本體，并劃分為47個組別。以FDR<0.01且FC≥2作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，三葉青根與莖葉的差異表達基因數(shù)目為4989個，其中上調(diào)為3511個，下調(diào)為1478個。對這些差異基因在不同組織內(nèi)的表達量做聚類分析，三葉青根和莖葉組織的基因呈現(xiàn)顯著的差異特征。根據(jù)功能和表達量對基因進行聚類，共聚為7大簇。第一簇共有1008個基因，GO功能注釋主要與分生組織的生長和微管的結(jié)合相關(guān)，這一類基因主要在莖葉中高表達。第二簇共有878個基因，GO功能注釋主要與天冬氨酰酯酶活性、果膠酯酶活性、轉(zhuǎn)錄因子等相關(guān)，這一類基因主要在根中高表達。第三簇共有1255個基因，GO功能注釋主要與一些酶的活性、電子傳遞、離子結(jié)合等相關(guān)，這一類基因主要在根中高表達。第四簇共有914個基因，GO功能注釋主要與抗壞血酸氧化酶活性、木脂素降解過程、對苯二酚氧化還原酶活性、植物細胞次生壁生物合成類型、木聚糖生物合成過程等相關(guān)，這一類基因主要在莖葉中高表達。第五簇共有3118個基因，GO功能注釋主要與光合作用功能相關(guān)，這一類基因主要在莖葉中高表達。第六簇共有1251個基因，GO功能注釋主要與氧化還原、氮的利用等功能相關(guān)，這一類基因主要在莖葉中高表達。最后一簇包含421個基因，GO功能注釋主要與萜烯合酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性、過氧化物酶等作用相關(guān)，主要在根中高表達。

3.4 三葉青根和莖葉中差異表達基因的COG注釋

利用COG數(shù)據(jù)庫對基因產(chǎn)物進行直系同源分類，共得到16 152條三葉青Unigene的同源序列，共分為25個類別。其中與生物過程相關(guān)的Unigene最多，有6526條，占40.41%，包括復(fù)制、重組和修飾（1125條，6.97%），轉(zhuǎn)錄（563條，3.48%）和信號傳導(dǎo)（396條，2.45%）；與功能預(yù)測類別相關(guān)的Unigene基因有2541條，占15.73%；此外，與代謝相關(guān)的Unigene基因數(shù)量為1548條，占總Unigene數(shù)量的9.58%。將三葉青根和莖葉中差異表達的基因比對到COG數(shù)據(jù)庫進行注釋，結(jié)果見圖1。

3.5 三葉青根和莖葉中差異表達基因的生物學(xué)代謝KEGG分析

根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫的注釋信息進一步將三葉青Unigene進行pathway注釋，其中有14 511條Unigene獲得對應(yīng)的Ko編號，大于2%注釋基因比例的10條代謝途徑見表2。利用KEGG數(shù)據(jù)庫對三葉青非冗余Unigene的pathway進行富集性分析，5個代謝通路又可分為130個信號代謝分支。其中核糖體合成途徑的Unigene數(shù)量最多，有1042條；而異黃酮的生物合成途徑只有1條Unigene，數(shù)量最少。

4 討論

高通量轉(zhuǎn)錄組測序可以高通量測定cDNA序列，揭示特定細胞或組織中表達的全部基因，成為中草藥生物學(xué)研究中的重要手段。三葉青微觀方面的研究較少，可供參考的遺傳背景較少，嚴重影響三葉青各種生物學(xué)性狀分子機理的研究，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可獲得大量的轉(zhuǎn)錄本信息，對解決三葉青基因進化、遺傳育種及生態(tài)等諸多方面的問題具有重要意義。本課題選用閩侯縣白沙基地的三葉青進行轉(zhuǎn)錄測序，并對原始序列數(shù)據(jù)（Raw Data）進行數(shù)據(jù)過濾、拼接，共獲得24.13 Gb Clean Data，且GC含量不低于47.13%，各樣品Q30堿基百分比均不小于94.18%，各項指標(biāo)均符合轉(zhuǎn)錄組分析的要求。用Trinity軟件對樣品數(shù)據(jù)進行序列組裝，共得到84 433條Unigene，N50為1180 bp，其長度集中在200～300 bp區(qū)間的數(shù)量占總Unigene序列的42.26%（35 684條）。利用BLAST軟件將Unigene序列分別與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、PFAM、eggNOG4.5、KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對分析，然后統(tǒng)計在各數(shù)據(jù)庫中注釋到的Unigene數(shù)目，最終獲得47 766個有注釋信息的Unigene，占全部Unigene的56.57%。其中NR數(shù)據(jù)庫注釋到的Unigene數(shù)量最多（44 769條，占53.02%），KEGG數(shù)據(jù)庫注釋到的數(shù)量最少（14 511條，17.19%）。利用GO數(shù)據(jù)庫注釋得到27 790條Unigene，可分成細胞組分、生物過程、分子功能3個基本功能本體，并劃分為47個組別。利用COG數(shù)據(jù)庫進行對比分析，共得到16 152條三葉青Unigene的同源序列，共分為25個類別，其中與生物過程相關(guān)的Unigene最多。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫的注釋信息進一步將三葉青Unigene進行pathway注釋，其中有14 511條Unigene獲得對應(yīng)的Ko編號，5個代謝通路又可分為130個信號代謝分支。

本研究首次利用Illumina HiSeq高通量測序技術(shù)對三葉青cDNA文庫進行測序，建立了三葉青的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，并對獲得的轉(zhuǎn)錄本信息進行序列組裝、功能注釋和分類，以及代謝通路分析，為三葉青生物學(xué)研究提供了寶貴的基因數(shù)據(jù)庫資源。

參考文獻：

[1] LIU D， CAO G， HAN L， et al. Flavonoids from Radix Tetrastigmae inhibit TLR4/MD-2 mediated JNK and NF-κB pathway with anti- inflammatory properties[J]. Cytokine，2016，84：29-36.

[2] QINGLIN L， XIN W， ZHONG L， et al. A study on the anti-tumor mechanism of total flavonoids from Radix Tetrastigmae against additional cell line based on COX-2-mediated Wnt/β-catenin signaling pathway[J]. Oncotarget，2017，8（33）：54304-54319.

[3] LIU D D， CAO G， HAN L K， et al. Flavonoids from Radix Tetrastigmae improve LPS-induced acute lung injury via the TLR4/MD-2-mediated pathway[J]. Mol Med Rep，2016，14（2）：1733-1741.

[4] FENG Z， HAO W， LIN X， et al. Antitumor activity of total flavonoids from Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg is associated with the inhibition of regulatory T cells in mice[J]. Onco Targets Ther，2014，7：947-956.

[5] 李清，李標(biāo)，郭順星.金釵石斛轉(zhuǎn)錄組SSR位點信息分析[J].中國中藥雜志，2017，42（1）：63-69.

[6] 朱畇昊，董誠明，鄭曉珂，等.基于轉(zhuǎn)錄組測序的山茱萸次生代謝生物合成相關(guān)基因的挖掘[J].中國中藥雜志，2017，42（2）：213-219.

[7] 謝騰，王升，黃蕾，等.基于轉(zhuǎn)錄組的新疆紫草ERF轉(zhuǎn)錄因子家族生物信息學(xué)分析[J].中國中藥雜志，2014，39（24）：4732-4739.

[8] 常越，閆嵩，劉振鵬，等.膜莢黃芪的轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量評估及其SSR位點信息分析的研究[J].中國中藥雜志，2016，41（8）：1430-1434.